酶催化CO2 还原制备高值化学品对缓解全球环境和能源危机具有重要意义,利用甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,FDH)或多酶级联还原CO2 制备甲酸/甲醇具有选择性高、条件温和的优势,但关键酶活性低、稳定性差和重复利用率低的问题限制了其规模化应用,酶的固定化为这些问题提供了有效解决方案.本文总结了近年来利用膜、无机材料、金属有机框架和共价有机框架等载体对酶进行固定化的研究进展,阐释了不同固定材料和固定方式的特点和优势;进一步总结了固定化酶与电催化或光催化耦联反应体系对 CO2 还原的协同效果及应用,同时指出酶固定化技术和耦联反应体系目前存在的问题并对其发展前景进行了展望.

利用甘油醛三磷酸脱氢酶(glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase,GAP)启动子在毕赤酵母中表达人鹅型溶菌酶2(human goose-type lysozyme 2,hLysG2),并在小试规模建立一套有效的重组hLysG2(recombinant hLysG2,rhLysG2)生产工艺流程.根据毕赤酵母密码子偏爱性设计并人工合成hLysG2基因,将其连接至pGAPZαA质粒中,构建重组表达质粒pGAPZαA-hLysG2.将重组表达载体线性化后电转化毕赤酵母GS115感受态细胞,通过Zeocin抗性筛选获取高拷贝重组菌株,并在5L生物反应器中进行发酵培养.发酵60h后发酵液上清酶活性达到最高,发酵液上清经SDS-PAGE及Western blot检测证实rhLysG2得到表达.与诱导型表达相比,组成型表达发酵时间缩短了48h,上清中rhLysG2总活性提高了23.8％;使用甲壳素亲和层析和分子筛层析对rhLysG2进行纯化后,每升发酵液上清可纯化到187.4mg重组蛋白,纯化产物纯度达99.0％以上;浊度测定法分析显示,在pH 5.6、30℃和0.1mol/L Na+的条件下,rhLysG2可达到最大酶活性13 500U/mg.利用GAP启动子在毕赤酵母中成功表达了高纯度和高活性的rhLysG2,避免了甲醇的使用,缩短了发酵时间,提高了蛋白产量,为将rhLysG2开发为新型抗耐药菌药物奠定了基础.

旨在构建S-亚胺还原酶(S-IRED)和葡萄糖脱氢酶(GDH)在大肠杆菌中的一菌双酶共表达系统,实现辅酶NADPH的再生,高效合成手性仲胺.利用无缝克隆的手段设计构建一种单质粒双启动子共表达系统,以全细胞为催化剂催化手性仲胺S-2-甲基吡咯烷(S-2MP)的合成,并研究温度、pH及有机溶剂对双酶反应的影响.成功构建了S-IRED和GDH的重组共表达质粒,实现了S-IRED与GDH在大肠杆菌中的胞内共表达,以亚胺2-甲基吡咯啉(2MPN)为模式底物,以工程菌全细胞催化手性仲胺S-2MP的合成,在低辅酶添加时催化手性胺的产率和光学纯度均高于95％.该双酶共表达体系的最适温度和pH分别为37℃和pH 8,10％ 以下的甲醇对双酶反应有正向促进作用.大肠杆菌胞内双酶共表达系统的构建实现了辅酶NADPH的原位再生,降低了亚胺还原酶催化合成手性胺的成本,为手性胺的规模制备奠定了基础.

甲醇是一种无色、透明、易燃、具有挥发性、易溶于水的液体[1],甲醇在肝脏乙醇脱氢酶作用下代谢为甲醛,后者在甲醛脱氢酶作用下代谢为甲酸[2].中毒的严重程度与血液甲酸浓度直接相关,口服甲醇5～10 ml致严重中毒,15 ml可致失明,30 ml致死.我科室收治1例患者,呈昏迷状态,独自居住,子女及工友均不能描述具体发病详情.现将该病例的诊断救治及护理体会经验总结如下.

旨在获得表达量高的FAD依赖的葡萄糖脱氢酶.通过FAD依赖的葡萄糖脱氢酶密码子优化,人工合成基因片段,构建重组表达载体pMD-GDH,转化毕赤酵母X33菌株后利用甲醇诱导培养实现分泌表达.结果显示,经试管水平筛选阳性转化子获得一株酶活高且稳定的重组菌株,在10 L发酵罐培养时经过136 h诱导培养,酶活达到257600 U/L.酶学性质分析表明,以葡萄糖为底物时最适温度和pH分别为55℃和7.0,在50℃下处理150 min仍有70％ 的活性,在pH 4-7范围内,37℃保温4 h,FAD-GDH仍能保持50％ 以上的活性.金属离子Cu2+对酶活抑制作用比较大.FAD-GDH的底物专一性较好,以葡萄糖为最适底物.经毕赤酵母密码子偏好性优化实现了FAD依赖的葡萄糖脱氢酶在毕赤酵母中的高效表达,为应用于血糖检测提供理论依据.

目的:考察甲基营养菌J1-1甲醇脱氢酶启动子活性与吡咯喹啉醌(PQQ)产量的相关性.方法:通过定点突变甲醇脱氢酶P0771启动子,利用lacZ作为报告基因检测突变启动子的转录水平,筛选出活性下降的突变启动子在J1-1中替换天然启动子获得突变菌株,检测突变菌株甲醇脱氢酶表达、酶活以及菌体生长和PQQ产量.结果:定点突变了7个P0771启动子,利用lacZ作为报告基因筛选出2个启动活性较天然启动子下降的突变启动子P0771-1、P0771-5,替换J1-1中天然启动子获得的突变菌株甲醇脱氢酶酶活都低于J1-1,在增菌培养基中其PQQ的合成水平分别提高约9.76％、11.6％.结论:通过启动子突变,降低甲醇脱氢酶启动子活性可以提高J1-1的PQQ产量.

为了提高甲醇酵母多形汉逊的生长性能并降低发酵成本,对其培养基中维生素和氨基酸有效成分进行优化.通过单因素实验和响应面实验相结合,最终确定了两种优化后的培养基组成,分别是以葡萄糖为碳源时的培养基,(NH4)2 SO42.5 g/L、KH2 PO414.4 g/L、MgSO4·7H2 O 0.5 g/L、trace-metal 2 mL/L、亮氨酸60 mg/L、葡萄糖20 g/L、生物素0.005 mg/L、甲硫氨酸40 mg/L、谷氨酸200 mg/L、天冬氨酸200 mg/L;以甲醇为碳源时的培养基,(NH4)2SO42.5 g/L、KH2PO414.4 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、trace-metal 2 mL/L、亮氨酸60 mg/L、甲醇10 g/L、生物素0.005 mg/L、维生素B11.04 mg/L.这两种培养基分别将菌种生物量(OD600)提高了6倍和1.5倍.优化后的葡萄糖培养基细胞中丙酮酸羧化酶活性提高了1倍,甲醇培养基细胞中丙酮酸脱氢酶酶活性提高3倍以上,丙酮酸羧化酶活性提高了8倍左右.综上,本研究为汉逊酵母大规模发酵提供了参考.

甲醇作为一种来源广泛、价格低廉、还原度高的非粮原料有望成为下一代生物制造的关键原料.利用合成生物学技术构建能够高效利用甲醇的重组微生物以实现从甲醇到高值化学品的生物转化已成国内外研究热点,但由于甲醇代谢过程的特殊性及复杂性,目前人工设计的甲基营养菌还难以实现以甲醇为唯一碳源进行生长及产物合成.基于对天然甲基营养菌甲醇代谢过程的分析,从甲醇脱氢酶的筛选与改造、甲醛同化途径的重构与优化、甲醇到化学品的生物转化几个方面对合成型甲基营养菌的构建策略及面临的挑战进行总结与分析,以期为今后合成型甲基营养菌的人工设计和利用提供一定的借鉴.

甲醇和甲烷等一碳原料来源广泛,价格低廉,是生物制造的理想原料.甲醇脱氢酶(Methanol dehydrogenase,MDH)催化甲醇生成甲醛是一碳代谢的关键反应.目前已从天然甲基营养菌中发现了多种利用不同辅因子,具有不同酶学性质的MDH.其中,烟酰胺腺嘌呤双核苷酸(NAD)依赖型MDH被广泛应用于构建人工甲基营养菌.但是,NAD依赖型MDH的甲醇氧化活性较低,对甲醇的亲和力较差,导致甲醇氧化成为人工甲基营养菌代谢甲醇的限速步骤.为了提高甲醇氧化速率,进而提高人工甲基营养菌的甲醇利用效率,近年来大量研究集中于MDH的挖掘与改造研究.文中系统综述了不同类型MDH的发现、表征、改造以及在人工甲基营养菌中的应用进展,详细阐述了MDH的定向进化和多酶复合体的构建,并展望了通过细胞生长偶联的蛋白质进化和蛋白质理性设计获得高活性MDH的潜在策略.

本文以课题组前期发现的高活性DHODH抑制剂A为基础,依据前药合成策略,对其羧基进行酯化修饰得到12个前药分子,旨在优化化合物A的稳定性.分子水平抑制活性显示12个前药分子中只有A1～A5有微弱活性,与其作用机制和前药设计相符;随后评价了A1～A12在有机溶剂甲醇和pH为2.0、9.0的缓冲液中的稳定性,结果显示A12在甲醇中能较好的抑制先导分子内成环,A1～A8在酸性条件下易于水解,A9～A12在碱性条件易于水解;最后评价了A1～A12的细胞增殖抑制活性,其中A12表现出很好活性,其IC50值为0.63μmol·L-1,与布奎那相当.这些结果为开展进一步体内活性研究奠定了基础.