病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术已广泛用于植物基因功能研究,以烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)为载体的沉默体系介导大豆基因沉默效率有待明确,采用无缝克隆技术构建TRV-VIGS沉默体系,探索不同接种方法对大豆靶基因在不同组织间的沉默效率,为大豆基因功能研究提供依据.以八氢番茄红素去饱和酶(phytoene desaturase,GmPDS)及泛素连接酶(GmATL3)基因为靶基因,将含有pTRV1 和重组载体菌液采用注射、灌根(agroinoculation)、注射与灌根相结合 3 种方法分别接种大豆中黄 13,接种 28 d观察沉默表型现象,并使用RT-qPCR技术检测根部与叶部基因相对表达量,明确不同方法沉默效果.注射接种的大豆叶边缘及叶内出现黄化褪绿,灌根接种与注射加灌根接种的叶片表面出现褪绿斑点及褶皱褪绿表型.RT-qPCR结果表明,3 种接种方法对沉默GmPDS效果接近 100%;注射接种对GmATL3 的沉默效率在叶部为 80%-95%,根部为 40%-60%;灌根与注射加灌根接种,根部沉默效率为 70%-90%,叶部沉默效率为 15%-50%.不同接种方法产生不同程度沉默表型,且对不同内源基因沉默效率不同.接种方法对不同组织沉默效率存在差异,注射方法对叶片沉默效率最高,注射加灌根结合的方法对根部沉默效率最高.

玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,Mcmv)是番茄丛矮病毒科玉米褪绿斑驳病毒属的唯一成员,可通过机械、种子和昆虫介体传播.其单独侵染玉米仅能引起轻微症状,但其与玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus,Mdmv)、甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,Scmv)或小麦线条花叶病毒(Wheat streak mosaic virus,Wsmv)等马铃薯Y病毒科(Potyviridae)病毒复合侵染会引起严重的玉米病害——玉米致死性坏死病(Maize lethal necrosis disease,Mlnd),造成玉米产量损失惨重.Mcmv在全球广泛分布,对玉米产业构成很大威胁.深入了解Mcmv并掌握其防治措施对玉米产业的健康发展至关重要.就Mcmv的生物学特性、分布与危害、鉴定与检测及基因组结构与功能等方面的研究进展进行综述,并对其防治策略进行探讨,以期为Mcmv的深入研究和综合防治提供理论指导.

[目的]本研究旨在建立TaqMan实时荧光定量PCR(TaqMan RT-qPCR)技术,快速检测单头烟粉虱Bemisia tabaci体内的番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus,ToCV).[方法]根据ToCV外壳蛋白保守序列设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了TaqMan RT-qPCR方法;与常规PCR检测进行比较,检测该方法的灵敏度与特异性;并应用该方法对单头烟粉虱成虫体内ToCV进行了快速检测.[结果]本研究构建的TaqMan RT-qPCR检测ToCV的标准曲线,其循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,扩增效率为98％.该方法对ToCV的最低检测浓度为8.3×10 copies/μL,灵敏度是常规RT-PCR的1 000倍.该方法与田间番茄两种重要病毒番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)和番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV)检测无交叉反应.单头烟粉虱成虫ToCV检测结果表明,温室内ToCV侵染植株上烟粉虱携毒率为100％,田间烟粉虱的携毒率为30％.[结论]本研究建立的TaqMan RT-qPCR检测方法,可快速有效检测单头烟粉虱体内ToCV携毒情况,为该病毒病的防控提供了技术支撑.

菊花容易受到病毒感染而造成品质下降,目前国内对菊花病毒的检测主要根据外观表现或者定性PCR检测,无法准确判定病毒载量.为构建一种可同时用于检测菊花B病毒(Chrysanthemum virus B,CVB)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)和菊花褪绿斑驳类病毒(Chrysanthemum chloritic mottle viroid,CChMVd)的实时荧光定量RT-PCR检测方法,本研究分别以保守区域作为靶标设计相应的引物探针,通过优化扩增体系中CVB、TAV、CChMVd 3种病毒/类病毒探针浓度、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度,摸索扩增程序中反转录时间、退火温度和扩增循环数,构建了一种可同时用于CVB、TAV、CChMVd的3重实时荧光定量RT-PCR检测体系,优化后的扩扩增体系中CVB、TAV和CChMVd的探针浓度分别为100 nmol/L、120 nmol/L和80 nmol/L,引物浓度分别为200 nmol/L、240 nmol/L和160 nmol/L,Mg2+浓度为3.0 mmol/L;dNTPs浓度200 μmol/L;最适反转录时间为25 min,退火温度为60℃,循环数为40.敏感性实验结果表明,该反应体系对3种病毒/类病毒的敏感性为1.0× 103拷贝/mL,敏感性好;定量线性范围为1.0×103拷贝/mL～1.0×1010拷贝/mL,线性范围宽;特异性好,对菊花矮化类病毒、烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒核酸检测结果为阴性;对1.0×104拷贝/mL的低浓度参考品平行检测10次,定量结果lg值偏差(CV％)为4.81％,重复性好.在南京农业大学"中国菊花种质资源保存中心"基地随机选择菊花20株进行本研究试剂检测,检出6例CVB病毒株和4例TAV病毒株,其病毒载量为2.5× 104拷贝/mL～5.5× 107拷贝/mL,随机选择1株CVB病毒株定量PCR,产物进行TA克隆后经测序与NCBI Blast比对,其与MH678704.1的同源性为100％.因此,本研究建立了一种能同时检测CVB、TAV、CChMVd3种菊花常见病毒/类病毒的灵敏、快速、可定量的检测方法.

[目的]本研究以番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus,ToCV)和番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)为主体,旨在明确ToCV单独侵染及TYLCV&ToCV复合侵染对烟粉虱Bemisia tabaci MED隐种寄主适应性的影响,并从寄主植物营养成分和防御角度解析不同番茄病毒侵染对烟粉虱MED隐种寄主适应性影响的生理机制.[方法]ToCV单独侵染和TYLCV&ToCV复合侵染番茄植株后,统计分析番茄植株上烟粉虱MED隐种成虫存活率和产卵量以及番茄植株中氨基酸和总糖含量;通过RT-qPCR技术检测番茄植株茉莉酸(JA)信号通路关键基因(FAD7和PI Ⅱ)以及水杨酸(SA)信号通路关键基因(NPR1和PR1)的表达模式.[结果]相对于取食健康番茄植株的烟粉虱成虫,取食番茄病毒侵染的番茄植株烟粉虱MED隐种成虫的存活率和产卵量均显著降低,其中以TYLCV&ToCV复合侵染番茄植株为寄主时,烟粉虱MED隐种成虫的存活率和产卵量均达到最低水平.TYLCV&ToCV复合侵染后,番茄植株中总氨基酸含量、14种水解氨基酸含量以及总糖含量低于ToCV单独侵染番茄植株.ToCV单独侵染和TYLCV&ToCV复合侵染番茄植株后,FAD7和PI Ⅱ的表达量均显著降低,并且2个基因在TYLCV&ToCV复合侵染植株中的表达水平最低;然而,NPR1和PR1的表达水平在ToCV单独侵染和TYLCV&ToCV复合侵染番茄植株中均有上升趋势,TYLCV&ToCV复合侵染番茄植株中NPR1表达水平和ToCV单独侵染番茄植株中PR1表达水平均显著高于健康番茄植株中的.[结论]ToCV单独侵染和TYLCV&ToCV复合侵染均能够明显降低番茄植株上烟粉虱MED隐种的寄主适应性,且TYLCV&ToCV复合侵染更不利于烟粉虱MED隐种生存;相对于健康番茄植株,ToCV单独侵染和TYLCV&ToCV复合侵染番茄植株营养成分与防御系统发生了变化且存在差异.研究结果为揭示烟粉虱与植物病毒互作提供了参考.

在实验室条件下研究了不同温度下刀角瓢虫Serangium japonicum对健康和感染番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)番茄上的烟粉虱Bemisia tabaci的捕食效果.结果表明,无论在健康番茄还是感染ToCV番茄上,刀角瓢虫均可以取食烟粉虱的卵和若虫,对卵的捕食量最大,且对烟粉虱卵的功能反应都属于HollingⅡ型反应,方程式分别为NA=0.9650N/1+0.0007N和NA=0.9866N/1+0.0006N.温度可以影响功能反应的参数,在30℃时刀角瓢虫对健康番茄上的烟粉虱的控制作用最好,在35℃时刀角瓢虫对感染ToCV番茄上的烟粉虱控制效果最好.刀角瓢虫偏好感染ToCV的番茄植株,对健康番茄偏好性较弱.刀角瓢虫对感染ToCV番茄上的烟粉虱具有良好的捕食效果,可为烟粉虱的生物防治提供合理依据.

为明确番茄褪绿病毒(ToCV)对其传毒介体烟粉虱Bemisia tabaci主要生物学特性的影响,本文研究了携带ToCV的Q型烟粉虱在非病毒寄主植物棉花Gossypium spp上的生物学指标,并测定了带毒和无毒烟粉虱主要保护酶和解毒酶活性.结果 表明,在棉花植株上,带毒烟粉虱在发育历期、产卵量、成虫寿命方面与无毒烟粉虱无显著差异,但雌虫体长明显短于无毒烟粉虱.相对于无毒烟粉虱,带毒烟粉虱体内过氧化氢酶(catalase,CAT)活性明显提高,是无毒烟粉虱的3.36倍(P ＜0.001),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化物酶(peroxidase,POD)活性无显著差异.解毒酶中,带毒烟粉虱羧酸酯酶(carboxylesterase,CarE)活性明显下降,是无毒烟粉虱活性的54％,谷胱甘肽S转移酶(glutathione-s-transferase,GST)和乙酰胆碱酯酶(acetylcholin esterase,ACHE)活性无显著差异.

朱顶红褪绿环斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspot virus,HCRV)流行和扩张速度极快,严重危害多种蔬菜和花卉产业,造成严重的经济损失,己上升成为中国南部地区正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)优势种.对不同地区HCRV分离株进行克隆,研究其在不同地区快速扩张和进化的机制对农业发展具有重要意义.本研究对2013-2015年在云南、广东、广西、福建和海南等5个中国南部地区采集的疑似感染Orthoto-spovirus属病毒的蜘蛛兰样本,采用RT-PCR技术鉴定、分离,得到10份HCRV新分离株,对其L序列进行克隆、测序.结合现有分离株,利用DNAMAN 7.0和MEGA 7.0进行分子多样性、系统发育和重组分析.结果显示,本研究的10份HCRV L分离株,包括1个最早报道的HCRV HLS1-2L分离株,可分为2个不同来源的类群.结合10份分离株采集地的环境信息,对比可看出其气候、温度、降水等差异很大,推测HCRV在中国南部地区的广泛分布与不同地区多态的气候类型有关,在它们的进化过程中,突变和重组发挥作用.RdRp是参与HCRV在细胞内的复制和转录的重要蛋白,对RdRp序列的分析,可为后续研究HCRV RdRp的遗传变异对HCRV侵染能力的影响提供理论基础,也为HCRV的防治提供思路.

[目的]由粉虱传播的番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus,ToCV)具有较强的暴发性和流行性,目前该病毒现已蔓延至世界各地,可为害多种作物,对农林经济生产造成严重危害.病毒侵染会影响介体昆虫的寄主选择性和取食行为,从而影响病毒传播.本研究旨在明确ToCV对MED烟粉虱Bemisia tabaci在不同寄主上的寄主选择性及取食行为的影响.[方法]利用Y型嗅觉仪测定携带和未携带ToCV的MED烟粉虱雌成虫的寄主选择性,利用刺吸电位(electrical penetration graph,EPG)技术比较携带和未携带ToCV的烟粉虱雌成虫在健康的番茄、辣椒、棉花和豇豆4种寄主植株上的取食行为差异.[结果]未携带ToCV的MED型烟粉虱雌成虫对于4种寄主植物的选择偏好性排序为番茄、辣椒＞棉花＞豇豆;携带ToCV烟粉虱雌成虫对4种寄主植物的选择性偏好性降低,排序为番茄、辣椒、棉花＞豇豆.与未携带ToCV烟粉虱雌成虫相比,携带ToCV烟粉虱雌成虫取食4种植物所产生的刺探次数均显著增加,第1次到达韧皮部的时间有明显延后,取食总时间与韧皮部的取食时间明显减少.[结论]ToCV使烟粉虱对寄主的选择偏好性和取食行为发生显著改变,从而增加了病毒在寄主植物间传播的可能.

[目的]分析与比较烟粉虱Bemisia tabaci ME AM1和MED成虫在辣椒Capsicum annuum植株上对番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus,ToCV)的传播差异,解析媒介昆虫-病毒-寄主植物间的互作关系,为田间辣椒上ToCV防治提供参考.[方法]利用烟粉虱MEAM1和MED成虫及ToCV cDNA侵染性克隆,对烟粉虱MEAM1和MED成虫在辣椒植株上获取和传播ToCV的能力进行比较,同时比较烟粉虱MEAM1和MED成虫在健康和携带ToCV辣椒植株上的取食偏好.[结果]在感染ToCV的辣椒植株上接虫后96 h内,烟粉虱MEAM1和MED成虫体内病毒积累量逐渐增加,MED成虫获毒速度和病毒积累量均大于MEAM1成虫的,MED成虫获毒量是MEAM1成虫的1.74倍;MED成虫在辣椒植株上的传毒量明显高于MEAM1成虫,传毒量平均相差9倍,且MED成虫传毒率比MEAM1成虫高29％.MEAM1和MED成虫对健康和感染ToCV的辣椒植株的取食偏好相似,都明显倾向于取食被ToCV侵染的辣椒植株.[结论]烟粉虱MED成虫在辣椒植株上获取、传播ToCV的能力均高于烟粉虱MEAM1成虫,这也是ToCV在我国大面积发生的一个重要原因.