目的:探讨低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)载体对胶原诱导关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)小鼠的治疗效果及其对巨噬细胞的作用机制。方法:对DBA/1小鼠注射牛Ⅱ型胶原建立CIA小鼠模型。建模成功的CIA小鼠分别给予尾静脉注射阴性对照腺病毒和HIF-1α-siRNA腺病毒，每周1次，共4周。实验分为空白组、CIA模型组、阴性对照组和HIF-1α-siRNA组。分离培养骨髓来源的巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages, BMDMs)，RT-PCR检测4组小鼠BMDMs中CD206、精氨酸(arginine, Arg)的相对表达量；流式细胞术检测小鼠脾脏和胸腺中F4/80 +CD16/32 +M1和F4/80 +CD206 +M2型巨噬细胞比例；HE染色观察小鼠踝关节的病理变化；免疫组化法检测小鼠滑膜组织中巨噬细胞及其亚型水平。 结果:(1)与空白组比较，模型组小鼠BMDMs中CD206 mRNA水平降低，Arg mRNA水平升高( P<0.01)。HIF-1α-siRNA可升高CIA小鼠BMDMs中CD206 mRNA表达水平( P<0.05)，降低Arg mRNA表达水平( P<0.01)。(2)与空白组比较，CIA模型组小鼠脾细胞和胸腺细胞中F4/80 +CD16/32 +M1巨噬细胞比例增加( P<0.05)，胸腺细胞中F4/80 +CD206 +M2巨噬细胞比例下降( P<0.05)。HIF-1α-siRNA可以降低CIA小鼠脾细胞和胸腺细胞中F4/80 +CD16/32 +M1巨噬细胞比例( P<0.05)，升高胸腺细胞中F4/80 +CD206 +M2型巨噬细胞比例( P<0.01)。(3)CIA小鼠踝关节的滑膜增生，以M1型巨噬细胞浸润为主；HIF-1α-siRNA可以减轻滑膜组织的增生及炎症细胞的浸润，尤其是M1型巨噬细胞的浸润。 结论:HIF-1α-siRNA可以降低胸腺细胞、BMDMs和小鼠滑膜组织中M1型巨噬细胞的比例，增加M2型巨噬细胞的比例，减轻CIA小鼠滑膜组织的巨噬细胞浸润和增生的情况，提示HIF-1α-siRNA可以通过调控M1型和M2型巨噬细胞的分化而起到治疗CIA小鼠的作用。

目的:探讨应激诱导蛋白Sestrin2（SESN2）对脂多糖（LPS）联合泛天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（caspase）抑制剂zVAD诱导小鼠树突状细胞（DC）坏死性凋亡的影响。方法:将培养至第3～10代小鼠骨髓来源树突状细胞系DC2.4给予LPS刺激0、6、12、24 h，并按照刺激时间点进行分组，采用蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测各组细胞SESN2蛋白表达水平。将过表达空载慢病毒（NC）、SESN2基因过表达RNA序列慢病毒（SESN2 LV-RNA）、小干扰空载慢病毒（NS）以及SESN2基因小干扰RNA序列慢病毒（SESN2 siRNA）分别转染至DC2.4细胞中，转染后72 h，于倒置荧光显微镜下观察细胞荧光表达改变。各转染组细胞给予LPS刺激24 h，同时设立空白对照组给予磷酸盐缓冲液（PBS）并培养24 h，采用Western blotting检测SESN2蛋白表达水平；给予LPS+zVAD刺激24 h，同时设立空白对照组给予PBS并培养24 h，采用Western blotting检测混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）、磷酸化MLKL（p-MLKL）蛋白表达水平，使用激光共聚焦显微镜观察p-MLKL变化及阳性细胞数量，采用流式细胞术和Hoechst染色检测坏死性凋亡细胞比例。结果:与LPS刺激0 h组相比，LPS刺激24 h组细胞SESN2蛋白表达明显升高，故将24 h作为后续实验LPS刺激时间点。成功转染慢病毒后培养24 h，SESN2 siRNA+LPS+zVAD组细胞MLKL磷酸化水平明显高于NS+LPS+zVAD组；SESN2 LV-RNA+LPS+zVAD组细胞MLKL磷酸化水平明显低于NC+LPS+zVAD组；且NS+LPS+zVAD组和NC+LPS+zVAD组MLKL磷酸化水平分别高于NS+PBS组、NC+PBS组。激光共聚焦显微镜下显示，各组细胞p-MLKL蛋白荧光表达数量及荧光强度变化趋势与上述结果一致。流式细胞术和Hoechst染色检测结果均显示，SESN2 siRNA+LPS+zVAD组坏死性凋亡细胞比例明显高于NS+LPS+zVAD组〔流式细胞术：（30.800±1.153）%比（20.800±1.114）%，Hoechst染色：（75.267±0.451）%比（46.267±3.371）%，均 P<0.05〕，提示敲减SESN2表达可以进一步加剧细胞坏死性凋亡发生；SESN2 LV-RNA+LPS+zVAD组坏死性凋亡细胞比例明显低于NC+LPS+zVAD组〔流式细胞术：（7.160±0.669）%比（19.240±2.322）%，Hoechst染色：（32.433±3.113）%比（48.567±4.128）%，均 P<0.05〕，提示过表达SESN2可以逆转上述改变。 结论:SESN2对于脓毒症状态下DC坏死性凋亡具有明显抑制效应，干预SESN2有助于调节脓毒症时DC介导免疫反应进程。

目的:探讨抑制树突状细胞相关RIG-1的表达从而抑制小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)成熟并促进免疫耐受的作用及其机制。方法:体外培养BMDC，并于第5天转染慢病毒载体Lv-RIG-1-RNA干扰(RNAi)(MOI＝100)，将其分为未成熟DC组，DC-绿色荧光蛋白(DC-GFP)组和DC-RIG-1-RNAi组，检测树突状细胞(DC)转染前后细胞表型[白细胞分化抗原(CD)40、CD80、CD86和主要组织相容性复合体 (MHC)Ⅱ]和功能变化；建立小鼠同种异体胰岛移植模型，术前3 d和1 d受体分别通过尾静脉注射1×10 6个DC-RIG-1-RNAi、DC-绿色荧光蛋白(GFP)和100 μl磷酸盐缓冲液(PBS)，观察各组移植术后胰岛存活时间，于术后第7天收集并比较受体糖耐量、胰岛移植物的病理学改变、脾脏T细胞亚群含量的变化。所有数据使用SPSS 22.0软件进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用 t检验。 结果:Lv-RIG-1-RNAi组DC中等水平表达CD80、CD86，低水平表达CD40、MHC Ⅱ，脂多糖(LPS) 刺激后白细胞介素(IL)-12分泌水平[(135.4±7.3) ng/L]低于imDC组[(823.0±30.9) ng/L， t＝68.483， P<0.05]和DC-GFP组[(896.4±47.7) ng/L， t＝49.870， P<0.05]，差异均有统计学意义，IL-10分泌水平[(556.6±50.4) ng/L]高于imDC组[(279.4±66.2) ng/L， t＝10.535， P<0.05]和DC-GFP组[(291.8±65.6) ng/L， t＝10.122， P<0.05]，差异均有统计学意义，并且其抗原提呈功能被有效抑制，具有一定程度的未成熟属性。DC-RIG-1-RNAi组胰岛生存时间[(38.5±3.8) d]高于对照组[(22.0±3.1) d， t＝8.241， P<0.05]和DC-GFP组[(9.5±2.1) d， t＝16.361， P<0.05]，差异均有统计学意义。术后第7天，DC-RIG-1-RNAi组胰岛移植受体葡萄糖耐量较其他两组好，病理学检测结果提示DC-RIG-1-RNAi组胰岛活性更好。DC-RIG-1-RNAi组辅助性T细胞17/调节性T细胞(Th17/Treg)比值(0.08±0.02)低于DC-GFP组(0.28±0.02， t＝11.670， P<0.01)和对照组(0.48±0.08， t＝20.110， P<0.01)，差异均有统计学意义。 结论:抑制RIG-1表达的DC表现出一定程度的未成熟表型和功能，保护小鼠胰岛移植物，诱导免疫耐受。

目的:探讨抑制NLRC5调控CD4 ＋T细胞功能对小鼠移植物的免疫保护作用。 方法:体外培养、纯化和富集小鼠(购自中山大学动物实验中心)脾脏来源CD4 ＋T细胞，转染短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体NLRC5-RNA干扰(RNAi)-绿色荧光蛋白(GFP)；随机分为3组，分别为对照组、T细胞组和NLRC5-RNAi组，每组5只。建立小鼠胰岛移植和皮肤移植模型，术前回输已转染慢病毒的CD4 ＋T细胞，术后观察各组胰岛和皮肤移植物生存情况，并于术后第7天检测移植胰岛和移植皮肤外周血细胞因子白细胞介素(IL)-10和干扰素(IFN)-γ的表达水平，流式细胞术检测小鼠脾细胞内淋巴细胞亚群分化情况。组间差异采用 t检验。 结果:移植术后NLRC5-RNAi组胰岛移植物葡萄糖耐受更好。NLRC5-RNAi组胰岛中位生存时间[(19.0±3.4) d]较对照组[(11.6±1.9) d， t＝5.156， P<0.01]和T细胞组[(10.0±1.4) d， t＝4.151, P<0.01]延长，差异有统计学意义。NLRC5-RNAi组皮肤移植物的中位生存时间[(15.4±3.8) d]较对照组[(8.0±0.9) d， t＝3.375, P<0.05]和T细胞组[(7.8±0.8) d， t＝3.848, P<0.05]延长，差异有统计学意义。外周血酶联免疫吸附试验(ELISA)检测提示胰岛移植NLRC5-RNAi组IL-10表达量[(344.0±4.1) ng/L]较其他组升高( t＝124.141， P<0.01)，IFN-γ表达量[(85.1±6.6) ng/L]较其他组降低( t＝7.633， P<0.05)，差异有统计学意义；皮肤移植NLRC5-RNAi组IL-10表达量[(275.9±12.5) ng/L]较其他组升高；IFN-γ表达量[(96.6±2.5) ng/L]较其他组降低，差异有统计学意义( t＝7.490， P<0.01)；流式细胞术提示胰岛移植NLRC5-RNAi组脾脏细胞中辅助性T细胞(Th2)含量[(0.190±0.053)%]较其他组升高( t＝5.220， P<0.05)，Th1含量[(0.810±0.036)%]较其他组降低( t＝6.219， P<0.05)；皮肤移植NLRC5-RNAi组Th2含量[(0.130±0.012)%]较其他组升高( t＝21.060， P<0.01)，Th1含量[(0.180±0.026)%]较其他组降低，差异有统计学意义( t＝9.248， P<0.05)。 结论:抑制NLRC5基因表达后，CD4 ＋T细胞分化偏向Th2，表达Th2型细胞因子增多，一定程度上延长了移植物存活时间，对移植免疫耐受的诱导具有积极意义。

目的:观察重复经脊髓磁刺激(repetitive trans-spinal magnetic stimulation,rTSMS)通过Notch1通路对脊髓神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的作用.方法:孕龄16周C57BU6小鼠处死后,迅速分离胎鼠全长脊髓,体外培养小鼠脊髓来源NSCs,通过单细胞测序及RNA速率分析检测脊髓NSCs亚群及速率变化特征.将体外培养的NSCs分为对照组、干预组及实验组.对照组将刺激探头置于培养皿上,不给予rTSMS刺激干预;干预组将刺激探头置于培养皿上,采用20Hz高频rTSMS、1500个脉冲刺激;实验组在转染Notch1 shRNA慢病毒后,进行rTSMS刺激,方案同干预组.采用Western blot检测各组Notch1表达量,免疫荧光染色和克隆球形成实验检测NSCs激活情况.结果:体外培养的脊髓NSCs可以诱导分化成为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,单细胞测序显示NSCs其可分为6个亚群并具有特殊异质性,Notch1主要表达在dNSCs和pNSCs两个亚群中.Notch1 shRNA慢病毒转染第5天后,细胞中Notch1蛋白表达量明显下降(对照组1.080±0.086 vs实验组0.520±0.041,P＜0.05).随后对照组给予假刺激,干预组及实验组给予rTSMS刺激,发现rTSMS显著提高NSCs内Notch1表达(对照组1.030±0.068 vs干预组1.480±0.087,P＜0.05).rTSMS干预后克隆球直径增大(对照组88.5±7.5 vs干预组106.2±8.8 vs实验组89.2±8.1,P＜0.05)和BrdU阳性细胞率提高(对照组38.6±3.7 vs干预组50.3±4.6,P＜0.05),有统计学差异.Notch1 shRNA干扰后,克隆球直径以及BrdU阳性细胞率均小于对照组,有统计学差异(P＜0.05).结论:rTSMS可在体外介导Notch1促进NSCs有效激活.

目的 探讨血红素氧合酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)对人退变椎间盘髓核细胞凋亡的作用及机制.方法 采用免疫组化和Western blot检测正常(LVF组,标本来源于年轻的椎体骨折行手术治疗的患者)及退变(IDD组,标本来源于椎间盘退变性疾病行手术治疗的患者)人椎间盘髓核组织中HO-1和磷酸化的P65(p-P65)的表达差异;体外培养退变髓核细胞,通过IL-1β处理增加髓核细胞凋亡,再用载HO-1质粒的慢病毒及小干扰RNA处理髓核细胞后检测凋亡的变化;通过P65抑制剂PDTC抑制p-P65表达后检测髓核细胞凋亡的变化.结果 免疫组化结果显示,HO-1在IDD组中的阳性表达率为(18.58 ±0.59)％,明显低于LVF组(58.26 ±2.48)％ (P ＜0.05),而p-P65在IDD组中的阳性表达率为(40.27±2.03)％,明显高于LVF组(19.75±1.98)％ (P ＜0.05).IL-1β能增加退变髓核细胞的凋亡,同时引起p-P65表达增加,HO-1-siRNA抑制HO-1表达后可以进一步提高髓核细胞凋亡率(P＜0.05),而过表达HO-1处理细胞后能够降低IL-1β引起的凋亡增加,同时降低p-P65表达(P＜0.05).使用P65抑制剂PDTC抑制髓核细胞P65信号通路后,髓核细胞凋亡率明显降低,此时沉默HO-1不能增加髓核细胞凋亡.结论 HO-1能够通过NF-κB通路抑制人退变椎间盘髓核细胞凋亡.

在过去几十年肿瘤药物治疗的研究中,传统的药物往往存在着易被降解、摄取率低及靶向性差等缺点,如何通过合适的载体进行有效运输,至今仍然是急需解决的难题.病毒、脂质体及聚合物等纳米级载体不断地发现与应用,但其靶向性和可控性仍未达到令人满意的程度.相比较病毒和脂质体而言,来源于细胞自身的外泌体,因其靶向性强、毒性小及免疫源性低等特点,克服了现有载体的应用障碍,使其有潜力成为一种新型的可应用于临床的药物载体.目前,外泌体已成功将小干扰RNA、微小RNA及紫杉醇等药物运输至靶细胞.迅速的清除率和较低的生产率是限制其临床应用的潜在因素,但外泌体的靶向修饰及模拟物的应用有效地解决了清除率、产量及靶向性等问题.本文就外泌体作为药物载体在肿瘤治疗中的研究进展做一综述,现报道如下.

目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)感染对乙酰胆碱酯酶(AchE)表达水平的影响以及细胞内AchE活性的变化对HCV感染的影响.方法 以细胞培养来源的HCV(HCVcc)感染人肝癌细胞系Huh7细胞,用蛋白质印迹法以及实时荧光定量PCR(qPCR)进一步验证HCV感染对AchE表达水平的影响,AchE活性检测试剂盒检测细胞内AchE活性的变化.以AchE抑制剂多奈哌齐和伊托必利处理Huh7细胞,同时用HCVcc感染,通过蛋白质印迹法以及免疫荧光法检测Huh7细胞的HCV感染情况.用针对AchE基因的小干扰RNA(siRNA)转染Huh7细胞,随后用HCVcc感染Huh7细胞,通过蛋白质印迹法和免疫荧光法检测AchE的表达以及HCV感染情况.结果 HCVcc感染Huh7细胞60 h后,AchE蛋白表达水平升高,同时酶活性也增强(P均<0.01).AchE抑制剂呈浓度依赖性抑制HCV对Huh7细胞的感染(P<0.01).用siRNA敲低AchE的表达后,HCV对Huh7细胞的感染降低(P<0.01).结论 HCV感染Huh7细胞能上调AchE的表达并增强AchE活性,AchE表达增加和活性增强都能促进HCV的感染,表明AchE在HCV感染Huh7细胞的过程中起着正反馈增强感染的作用.

RNA沉默是真核生物体内由病毒来源的干扰小RNA (virus-derived small interfering RNA,vsiRNA)沉默复合物介导目标RNA特异降解的一种保守机制,通过对vsiRNA分析可进行植物病毒病原鉴定.本文利用小RNA深度测序技术对感病半夏叶片进行鉴定,结果发现,表现典型花叶症状的半夏叶片受到大豆花叶病毒(Soybeanmosaic virus,SMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus,DsMV)、魔芋花叶病毒(Konjac mosaic virus,KoMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)等多种病毒的复合侵染.为明确SMV山西半夏分离物(SMV-SXBX)的进化关系,进行SMV-SXBX全基因组克隆与分析,获得SMV-SXBX全长为9735 nt,编码一个由3 105个氨基酸组成的多聚蛋白质.通过核苷酸与氨基酸序列比对发现,SMV-SXBX与半夏分离物P同源性最高,分别为91.1％和94.1％,且系统发育分析表明,SMV-SXBX与半夏SMV分离物P聚为一簇.同时,也对vsiRNA进行了系统分析,研究结果有望为半夏SMV的有效防治提供一定科学依据.

目的 观察耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)对小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)焦亡的影响,探究MRSA诱导巨噬细胞焦亡的作用机制.方法 采用脂多糖(LPS,1 00 ng/ml)与尼日利亚菌素(nigericin,Ng,10mmol/L)或三磷酸腺苷(ATP,3 mmol/L)联用或MRSA单独刺激的方式构建细胞焦亡模型;通过细胞形态学观察以及乳酸脱氢酶(LDH)检测,评价细胞膜完整性以及细胞毒性;采用ELISA法测定细胞培养液中白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α等炎症因子的表达水平;采用Western印迹法检测细胞培养上清以及细胞内胱天蛋白酶(caspase)-1和IL-1β蛋白表达水平;采用慢病毒短发夹RNA(shRNA)干扰BMDM内相关炎症小体感受器分子表达,检测MRSA诱导细胞焦亡的信号通路.结果 LPS分别与Ng或ATP联用时能破坏BMDM细胞膜完整性,上调炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平(P＜0.01),以及caspase-1和IL-1β成熟形表达水平(P＜0.01);MRSA单独刺激能产生细胞毒性,诱导炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平显著升高(P＜0.01),并提高caspase-1和IL-1β成熟形在培养基中释放水平(P＜0.01);在BMDM细胞内敲除NLRP3或NLRC4基因表达后,MRSA诱导的IL-1β表达量下降(P＜0.01).结论 MRSA可能通过NLRP3炎症小体或NLRC4炎症小体诱导BMDM细胞焦亡.