相思子毒素是目前已知毒性最强的植物毒素蛋白,受到国际《禁止化学武器公约》和《禁止生物及毒素武器公约》共同关注,亟须有效的检测和解毒对抗措施,以应对其对于人类健康和公共安全的潜在威胁.该文在文献聚类研判的基础上,结合对相思子毒素的多种亚型结构的认识,对其分析检测技术、毒性机制、解毒对抗措施进行了全面综述,最后阐述了该领域的难点及发展趋势.目前主要的相思子毒素分析检测技术包括亲和分析、理化分析以及活性检测技术三大类,亟须发展灵敏特异准确的结构与活性测定技术方法,以准确厘清毒素威胁.目前尚无有效解毒剂,治疗仅为对症治疗.研发中和抗体仍然是对抗其中毒最有潜力的手段.

目的:评价重组相思子毒素B链蛋白(rATB)免疫雌性BALB/c小鼠的免疫效果,并初步探讨其免疫机制.方法:以rATB为免疫原,腹腔免疫雌性BALB/c小鼠,间接ELISA方法检测小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a,流式细胞技术检测IFN-γ、IL-4,并进行天然毒素攻毒实验和体外中和实验.结果:血清IgG、IgG1效价达到1:106以上,且攻毒后产生二次免疫应答,与PBS对照组差别有统计学意义(P<0.05);而IgG2a的血清效价未发生明显变化.细胞因子检测结果表明IFN-γ的表达量与PBS组差异无统计学意义,而IL-4的表达量显著提高(P<0.05).小鼠攻毒保护实验和体外中和实验结果说明,腹腔注射rATB可以抵抗最高剂量为5×LD50的天然AT毒素中毒,保护率为100%.结论:rATB蛋白免疫小鼠后显示出良好的免疫原性,能诱导以IgG1为主的抗体和Th2优势应答,为候选疫苗的研制奠定基础.

目的 探讨重组相思子毒素B链蛋白(rATB)的冻干保存条件及其免疫雌性Balb/C小鼠后的免疫效果评价.方法 rATB分别与不同冻干保护剂配方混合进行真空冷冻干燥,复融后免疫小鼠4次.每次免疫后,间接ELISA方法检测小鼠血清中IgG效价,四免后采用相思子毒素(abrin toxin,AT)攻毒,并进行小鼠体外中和试验.结果 rATB与10 g/L的蔗糖混合保存所测浓度最高,纯度可达98％以上.四免后rATB组血清IgG效价与PBS对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).攻毒保护试验和体外中和试验结果说明,rATB可以抵抗5×LD50的天然AT攻毒.结论 rATB和10 g/L蔗糖混合冻干条件下所测定的浓度最高,且冻干蛋白复融后免疫小鼠后显示出良好的免疫原性.

[目的]探讨重组蓖麻毒素、相思子毒素B链蛋白(RTB-ATB)免疫Balb/C小鼠的免疫机制.[方法]雌性Balb/C小鼠随机分为两组:RTB-ATB组和PBS组,分别腹腔免疫4次,间隔1周;间接ELISA检测血清中IgG效价和抗体分型,流式细胞技术检测细胞因子IFN-γ、IL-4,并进行攻毒实验和体外中和实验.[结果]四免后RTB-ATB组血清IgG、IgG1的效价与PBS对照组差别有统计学意义(P＜0.05),而IgG2a未发生明显变化;IL-4的表达量RTB-ATB组与PBS组相比差别有显著性(P＜0.05),而IFN-γ未发生变化(P＞0.05).攻毒保护实验和体外中和实验结果说明,嵌合体蛋白RTB-ATB可以抵抗4×LD50的天然AT或RT攻毒.[结论]RTB-ATB诱导以IgG1为主的抗体和Th2优势应答且显示出良好的免疫原性,为二价疫苗的研制奠定基础.

目的 利用荧光免疫层析技术,研发定量检测相思子毒素的试纸条.方法 采用亲和层析法纯化相思子种子,用凝胶过滤层析纯化天然相思子毒素,制备鼠抗相思子毒素单克隆抗体和兔抗相思子毒素多克隆抗体,将特异性单抗结合荧光微球,兔多抗包被检测线,羊抗鼠二抗包被质控线,建立相思子毒素双抗体夹心定量检测方法及其试纸条,并对该试纸条进行性能评价.结果 经纯化获得分子量31kDa的相思子毒素A链和33 kDa的B链.研发的荧光免疫层析试纸条配合荧光免疫检测仪在0～50 ng/ml的检测范围内拟合曲线R2=0.990,线性范围为1～10 ng/ml,最低检出限为1 ng/ml.批间、批内重复性均小于15％,常温稳定性14个月,采用动物血清和食物模拟样本检测特异性良好.结论 开发的荧光免疫层析试纸条可以用于食品和环境中相思子毒素的检测.

目的 制备了一种基于免疫分析的光子晶体传感材料,可以对相思子毒素进行无标记超灵敏检测.方法 在24孔板中用附着有金纳米粒子(AuNPs)的二氧化硅微球(SiO2)通过自组装方法堆垒蛋白石光子晶体(PC),并用相思子毒素多克隆抗体(pAb)修饰光子晶体以实现传感材料对相思子毒素的特异性识别.结果 在优化后的检测条件下,光子晶体衍射峰的强度随相思子毒素浓度的增加而降低.检测方法的线性范围为0.10 pg/mL至10 ng/mL,检出限为11 fg/mL.此外,饮用水和牛奶样品的加标回收实验表明,加标回收率为91.45％ ～113.61％.结论 该传感材料不仅可以实现相思子毒素的超灵敏无标记检测,而且具有制备简便,响应迅速,操作简单等优点,在检测、诊断和监测领域具有广阔的应用前景.

目的 利用镧系荧光技术建立定量检测A型肉毒毒素方法,并验证该方法的检测效果.方法 分别用A型肉毒毒素单克隆抗体和鸡IgY抗体标记镧系荧光纳米微球,在硝酸纤维素膜上包被A型肉毒毒素多克隆抗体作为检测线,包被山羊抗鸡IgY的IgG抗体作为质控线,建立A型肉毒毒素检测方法,分析方法的准确度、特异性、灵敏度和可重复性.结果 建立的A型肉毒毒素镧系荧光法可在20 min内完成检测,灵敏度为5 IU/ml,与黄曲霉素B1、呕吐毒素、T2毒素、相思子毒素和蓖麻毒素无交叉反应,批内重复性和批间重复性变异系数均小于15％.结论 镧系荧光法的建立为A型肉毒毒素快速、高效检测提供了可靠保障.

目的 建立一种快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)的均相光激化学发光免疫分析法(AlphaLISA).方法 待测样本中的SEA与偶联有羊抗SEA多克隆抗体的受体微球、生物素化的小鼠抗SEA单克隆抗体发生反应,形成双抗体夹心结构,再与包被链霉亲和素的供体微球形成复合体.680 nm波长荧光激发供体微球上的光敏剂产生单线态氧,触发受体微球发出615 nm波长荧光,多功能酶标仪检测信号值,信号值高低与待测样本中SEA的浓度呈正比.结果 缓冲液中SEA的最低检出限(LOD)为0.1 ng/ml,线性范围0.2～50 ng/ml,相关系数R2为0.9941.检测体系不易受高糖、高盐和高蛋白等样本基质的影响,牛乳等液态模拟样本和10％(w/v)稀释的奶粉、豆干、火腿肠等固态食品模拟样本的LOD均为0.1 ng/ml.检测体系与其他4种肠毒素(SEB、SEC、SED、SEE)、A型肉毒毒素、蓖麻毒素、相思子毒素均无交叉反应,特异性较好.无论是缓冲液还是模拟样本检测,变异系数均小于10％,具有较好的重复性.结论 该法操作流程简便,检测灵敏度高、特异性强,检测时间为25 min,在金黄色葡萄球菌性食物中毒的鉴别诊断中具有较好的应用前景.

相思子毒素是一类来源于植物的Ⅱ型核糖体失活蛋白,能抑制真核细胞的蛋白质合成,引起细胞死亡.该毒素来源广泛,易提取,毒性强且缺乏有效的解毒剂,已经被美国确定为B类生物战剂.相思子毒素依靠其B链入胞、A链作用于核糖体RNA发挥脱嘌呤作用,在不同细胞模型中通过激活不同的信号通路诱导细胞凋亡.基于特异性抗体的免疫学检测方法是检测相思子毒素的主要手段,如酶联免疫吸附法和电化学发光法,能检测复杂环境中的相思子毒素,最低检出限可达0.5μg·L-1;此外,基于质谱法和核酸适配体的检测方法也可高效、灵敏地定量分析待测样品中的相思子毒素.在毒素中毒防治方面,基于重组相思子毒素A链或B链蛋白制备的疫苗能提供良好的预防效果.同时,利用杂交瘤技术或噬菌体展示库等手段筛选能有效中和相思子毒素的特异性抗体,为治疗其中毒提供了良好的办法.本文综述相思子毒素的结构特征、毒作用机制、检测及其中毒防治的研究进展.

目的:制备并评价针对相思子毒素(Abrin)的具有中和活性的特异性人源化嵌合抗体.方法:从鼠源单抗中钓取抗体可变区轻重链序列4条,两两配对载入人源化IgG1表达载体pFRT-KIgG1,经表达、纯化等步骤得到4株人源化嵌合抗体;间接ELISA测定嵌合抗体与Abrin的结合力;ForteBio测定嵌合抗体与Abrin的亲和力;体外细胞学实验鉴定抗体的中和功能;无细胞体系评价抗体是否阻碍Abrin抑制荧光酶合成;选择6～8周雌性BALB/c小鼠,腹腔注射Abrin和不同浓度抗体,观察抗体的体内保护效应;流式细胞术分析抗体是否阻断Abrin与细胞的结合.结果:ELISA和ForteBio结果显示,4株嵌合抗体中仅H1L1嵌合抗体与Abrin的结合[EC50=(0.1212±0.0040)μg/ml和亲和力(亲和常数3.97×10?10 M)]与母本抗体[EC50=(0.15825±0.00235)μg/ml,亲和常数5.59×10?10 M]相似;体外细胞保护试验显示,H1L1[EC50=(3.7455±0.0575)ng/ml]约为母本抗体[EC50=(1.5825±0.5335)ng/ml]中和作用的42％;无细胞体系荧光素酶合成试验显示,H1L1[EC50=(0.6729±0.0755)μg/ml]与母本抗体[EC50=(1.0365±0.0045)μg/ml]接近,均能逆转Abrin抑制蛋白合成的作用;BALB/c小鼠体内中和保护实验结果显示,H1L1与10D8均能提供良好的体内保护作用;流式细胞术分析发现,H1L1并不能通过抑制Abrin黏附或进入细胞抑制其毒性.结论:4株嵌合抗体中,仅H1L1是轻、重链正确配对且拥有良好中和活性的候选抗体,有潜在的用于Abrin中毒救治的开发价值,应用前景良好.