目的:观察腺病毒介导的"睡美人"(SB)转座子与白细胞介素10(IL-10)共表达对非肥胖糖尿病(NOD)小鼠脾细胞中Th17/Treg 细胞平衡的影响,阐明 IL-10对 NOD小鼠的可能治疗机制.方法:提取C57BL6小鼠的脾细胞并培养,将脾细胞分为对照组、空载体组和治疗组.对照组脾细胞不做任何处理,空载体组将不含 IL-10基因而有转座子序列的腺病毒载体和不含转座酶的腺病毒载体共同感染小鼠脾细胞,治疗组将含有 IL-10基因和转座子序列的腺病毒载体以及含有转座酶的腺病毒载体共同感染小鼠脾细胞.感染48 h后 RT-PCR法检测各组小鼠脾细胞中 IL-10 mRNA表达水平.感染48 h后将上述3组处理的脾细胞分别种植到对照组、空载体组和治疗组 NOD小鼠右后腿的腘窝皮下,每组6只小鼠,每周注射1次,共6次.注射结束后4周处死小鼠,ELISA法检测各组 NOD 小鼠血清中 IL-10表达水平;流式细胞术检测各组 NOD 小鼠脾细胞中CD4+IL-10+、CD4+IFN-γ+、Th17和Treg细胞的比例.结果:与对照组和空载体组比较,治疗组C57BL6小鼠脾细胞中 IL-10 mRNA表达水平明显升高(F=72.71,P<0.05),NOD小鼠血清中 IL-10表达水平明显升高(F=8.89,P<0.05),NOD小鼠脾细胞中 CD4+IL-10+细胞和 Treg细胞比例明显升高(F=72.09,P<0.05;F=12.98,P<0.05);但治疗组小鼠脾细胞中 Th17细胞比例明显下降(F=6.39,P<0.05);NOD小鼠脾细胞中CD4+IFN-γ+细胞比例在对照组、空载体组和治疗组之间比较差异无统计学意义(F=2.72,P>0.05).结论:腺病毒介导的 SB转座子与 IL-10共表达后可以升高 NOD小鼠血清中 IL-10表达水平;同时可明显升高 NOD小鼠脾细胞中CD4+IL-10+细胞比例,降低 Th17细胞比例,升高 Treg细胞比例,调控Th1/Th2和Th17/Treg的平衡,对 NOD小鼠起到治疗作用.

为研究睡美人(Sleeping Beauty,SB)转座子系统在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾脏细胞(CIK)中介导的整合特性,构建了SB转座子和转座酶在两个质粒的二元反式(trans)转座子系统,以及转座子和转座酶元件在同一个质粒的一元顺式(cis)转座子系统;通过转染CIK细胞,用荧光显微镜、流式细胞仪和荧光定量PCR分析了转染2d后及嘌呤霉素筛选4周后的细胞,测定DsRed转染效率和整合效率,并结合高效热不对称交互式PCR扩增获得SB转座子整合位点的序列.结果表明, SB二元转座子系统的整合效率远高于一元系统; SB转座子与转座酶比例为1:2时,外源基因DsRed的整合效率最高;SB转座子偏向于插入草鱼基因组TA序列处.研究表明优化SB转座子和转座酶的比例能提高外源基因在草鱼细胞中的整合效率并快速获得突变细胞, 同时为在鱼类细胞中采用SB转座子建立突变体文库提供理论基础.

目的 利用水流动力学质粒转染方法建立小鼠肝内胆管癌(ICC)动物模型,比较两种睡美人(SB)转座酶SB100与SB13对ICC动物模型成瘤率的影响.方法 利用水流动力学注射方法将表达myr-Akt基因的转座子,NICD1转座子分别与SB100(A组)、SB13(B组)质粒溶液通过小鼠尾静脉注射入肝脏.注射NICD1和myr-Akt质粒作为C组,注射等量生理盐水作为D组.注射4周后处死,行病理学检查.免疫组织化学检测CK19和HA作为胆管细胞性肝癌诊断指标.结果 A组小鼠成癌率100％(20/20),B组小鼠成癌率70％(14/20),病理结果及免疫组织化学表明小鼠形成肿瘤为胆管细胞性肝癌,其中A组CK19强阳性表达率为55％,HA强阳性表达率为60％;B组CK19强阳性表达率为60％,HA强阳性表达率为65％;C、D组均无阳性表达.结论 SBI00较SB13可显著提高成瘤率.

目的 利用高压静脉注射转染法经小鼠尾静脉转染蛋白激酶B(AKT)、β联蛋白(β-catenin)及睡美人转座子质粒建立伴脂肪肝的炎癌转化小鼠肝癌模型并对该模型进行鉴定.方法 选取6—8周龄雄性C57BL/6小鼠,通过高压静脉注射转染法在短时间内(5—9 s)经尾静脉注射含目的DNA的等渗生理溶液(20 μg myrAKT、20 μg AN90-β-catenin和4μg Sleeping Beauty transposase溶于2mL生理盐水),对照组采用相同方法注射对照质粒.于建模8、12、16周后,处死小鼠并收集血清及肝组织,提取RNA.HE染色检测肝脏组织结构及炎性细胞浸润程度;油红O染色检测肝细胞内脂质沉积情况;天狼星红和Masson染色检测肝组织纤维化程度;免疫组织化学染色检测肝组织KI-67抗原(ki67)表达显示细胞增殖活性、检测CD31表达显示微血管密度及分布情况;实时荧光定量PCR检测肝组织肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)的mRNA表达;流式细胞术检测肝组织内各免疫细胞亚群数量变化.结果 小鼠经高压静脉注射转染法建模16周后,实验组小鼠成瘤率1 00％(20/20).与对照组相比,实验组小鼠体质量增长缓慢,肝质量显著增加.HE染色结果显示,大量肝细胞出现脂肪变,炎性细胞浸润增多,肝癌组织内肿瘤细胞为类圆形或不规则形,核质比失调,异型性显著,呈团块状分布;ki67阳性细胞数增加.血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、γ谷氨酰转肽酶(γ—GT)、碱性磷酸酶(ALP)水平显著升高,AFP mRNA表达显著上升,CD31表达检测显示微血管密度增加且结构紊乱.流式细胞术分析肝脏中大量炎性细胞浸润,且以髓系及淋巴系为主.结论 通过高压静脉注射转染法在肝细胞中激活AKT和β-catenin成功建立了伴发脂肪肝的炎癌转化小鼠肝癌模型,且方法简便,诱导时间短,成瘤率高,重复性强.

目的 为解决杆状病毒作为基因传递载体瞬时表达缺陷,拟构建睡美人(SB)转座子介导的杆状病毒表达载体,通过检测绿色荧光蛋白EGFP的表达变化来评价该系统在哺乳动物体内外的表达效率.方法 以pFastBac DUAL质粒为骨架,将pPh启动子替换为CMV-SB100X-SV40 PA表达元件,然后在其下游插入IR/DR-CMV-EGFP-SV40 PA-IR/DR表达元件,获得的质粒命名为pBacSB-CE;同时作为对照构建pBac-CE,在pPh启动子下游插入CMV-EGFP表达元件.将构建好的重组质粒转化大肠杆菌DH10Bac,经蓝白斑筛选后转染Sf-9细胞,获得重组杆状病毒BacSB-CE和Bac-CE.将重组病毒转导人胶质瘤U87细胞,通过MTT、倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞的增殖以及EGFP的表达效率;建立裸鼠皮下胶质瘤肿瘤模型,通过组织免疫荧光进一步观察重组病毒在体内的转导效率.结果 经PCR鉴定成功获得了重组病毒BacSB-CE和Bac-CE;MTT结果证实重组病毒对U87细胞的增殖无副作用;倒置荧光显微镜和流式结果显示,EGFP在BacSB-CE转导的U87细胞中至少能表达60 d,在转导15 d后仍能检测到约109 a.u.总荧光强度,而在Bac-CE转导的细胞中,15d后已检测不到荧光细胞和荧光信号;体内组织免疫荧光检测进一步显示BacSB-CE组在第10天时仍能检测到绿色荧光细胞,而Bac-CE组在第5天时基本看不到荧光细胞.结论 该研究成功构建了SB转座子介导的杆状病毒基因传递系统,获得的重组病毒对哺乳动物细胞具有良好的安全性,并能介导EGFP在哺乳动物体内外持续稳定表达.

目的 利用"睡美人"(SB)转座系统构建可表达红色荧光蛋白和荧光素酶基因的黑色素瘤B16F10细胞系,建立可视化黑色素瘤动物模型.方法 从含荧光素酶Luc2的质粒中获取Luc2基因,用NcoⅠ和XbaⅠ限制性内切酶双酶切后插入pSBbi-RP SB转座子系统.构建的重组pSBbi-Luc2-RP转座质粒与转座酶按照一定比例转染黑色素瘤细胞B16F10,利用荧光显微镜观察转染效率,经嘌呤霉素筛选稳定转染的细胞系.利用活体成像系统可视化实时监测评价小鼠皮下成瘤模型.结果 利用SB转座系统成功构建黑色素瘤B16F10细胞系,24、48 h转染率分别达40％、70％,上述细胞系经皮下成瘤后1周活体动物成像系统可检测到肿瘤形成.结论 利用SB转座系统可快速建立可视化黑色素瘤细胞系,利用小动物活体成像系统可动态观察黑色素瘤动物模型中肿瘤生长情况.