采用RT-PCR技术从草鱼肝脏中克隆了成纤维细胞生长21(FGF21)基因序列,并利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术对该基因在草鱼幼鱼不同组织中表达进行了研究.结果表明,草鱼FGF21基因(GenBank登录号为MF_094727)cDNA序列全长615 bp,其中5'端非翻译区51 bp,开放阅读框564 bp,编码187个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明,草鱼FGF21基因与斑马鱼同源性最高(78.86％),与犀角金线鲃、鲤、虹鳟、大西洋鲑、罗非鱼和日本青鱂的同源性分别为77.66％、73.94％、53.29％、52.41％、43.71％ 和35.96％,与人和小鼠同源性较低,分别为31.87％ 和30.39％.qPCR分析表明:FGF21基因在草鱼幼鱼肝脏、前肠、中肠、后肠、心脏、肌肉、肾脏和全脑中均有表达,在肌肉、前肠和中肠表达量最高,表明该基因可能在草鱼肌肉和肠道等组织发挥重要作用.

为研究睡美人(Sleeping Beauty,SB)转座子系统在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾脏细胞(CIK)中介导的整合特性,构建了SB转座子和转座酶在两个质粒的二元反式(trans)转座子系统,以及转座子和转座酶元件在同一个质粒的一元顺式(cis)转座子系统;通过转染CIK细胞,用荧光显微镜、流式细胞仪和荧光定量PCR分析了转染2d后及嘌呤霉素筛选4周后的细胞,测定DsRed转染效率和整合效率,并结合高效热不对称交互式PCR扩增获得SB转座子整合位点的序列.结果表明, SB二元转座子系统的整合效率远高于一元系统; SB转座子与转座酶比例为1:2时,外源基因DsRed的整合效率最高;SB转座子偏向于插入草鱼基因组TA序列处.研究表明优化SB转座子和转座酶的比例能提高外源基因在草鱼细胞中的整合效率并快速获得突变细胞, 同时为在鱼类细胞中采用SB转座子建立突变体文库提供理论基础.

为探究草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒VP6和VP38蛋白的生物学功能,利用酵母双杂交Gal4系统分别筛选了能与GCRV104毒株编码的VP6和VP38相互作用的宿主蛋白.利用RT-PCR从感染GCRV104的草鱼肾脏细胞中扩增GCRV104 s8和s10基因组片段的编码基因后,通过酶切与连接分别克隆至载体pGBKT7中,构建诱饵质粒pGBKT7-VP6和pGBKT7-VP38.对这些重组质粒进行细胞毒性和自激活检测后,分别以VP6和VP38为诱饵在草鱼酵母文库中筛选与其相互作用的宿主蛋白,对筛选得到的阳性酵母菌落进行序列分析.结果表明,两个诱饵质粒pGBKT7-VP6和pGBKT7-VP38均无自激活作用;诱饵质粒pGBKT7-VP6筛选到7株阳性克隆,分别编码β肌动蛋白、augmin样复合体亚基2、甘露糖苷酶α2b1亚基、程序性细胞死亡蛋白6、真核翻译延长因子1γ和一个未知功能蛋白;诱饵质粒pGBKT7-VP38筛选到4株阳性克隆,分别编码剪切与多聚腺苷酸化特异性因子5、高迁移率组蛋白核小体结合结构域2、葡萄糖转运体X和蛋白酶体亚基β7.结果为进一步探究GCRV104毒株编码的VP6、VP38与宿主蛋白及其涉及的信号通路的相互作用奠定了基础.

ROCK1 是ROCK (即Rho 激酶)家族的成员之一,ROCK 家族是小G 蛋白Rho 的下游效应因子,被 Rho 蛋白激活后ROCK1 作用于下游效应分子,对其介导的信号通路进行调节,参与细胞增殖、迁移、形态改变等.ROCK1 与组织纤维化、癌症、心血管等疾病的发生密切相关.本实验采用cDNA 末端快速扩增法克隆草鱼ROCK1 基因全长序列,预测并分析其编码的蛋白,采用实时荧光定量PCR 法检测草鱼ROCK1 基因的组织差异表达.实验首次克隆获得了草鱼ROCK1 基因全序列,长4 604 bp,编码1 361个氨基酸;草鱼ROCK1氨基酸序列与金线鲃、斑马鱼、鲤鱼ROCK1 的氨基酸序列同源性分别达95％、94％、94％,同源性较高;草鱼 ROCK1 蛋白分子量158 035.73,理论等电点5.69,为亲水性非分泌蛋白,无信号肽;其二级结构包括α-螺旋(α-helix)、β-重叠(β-strand)和环(loop).组织差异表达显示草鱼ROCK1 基因在各组织中均有表达,其中在脑和血液中表达量最高(p＜0.05),其次为鳃、心脏、肾脏、脾脏和前肠组织,肌肉和肝脏组织表达量较低,皮肤组织表达量最低,所得结果将为后续研究草鱼组织纤维化奠定基础.

在脊椎动物中viperin已被证明是一种能抵御大多数DNA和RNA病毒的抗病毒蛋白质.本文克隆及鉴定了青鱼viperin.青鱼viperin (bc Viperin) 的c DNA由1 828个核苷酸组成, 编码360个氨基酸.预测的bc Viperin蛋白包含N端低保守的两性α-螺旋结构域、中间自由基S-腺苷甲硫氨酸 (S-adenosylmethionine, SAM) 结构域及高保守C端结构域.bc Viperin m RNA在青鱼心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠、肌肉、皮肤和鳃等组织中均有表达.在草鱼呼肠孤病毒 (grass carp reovirus, GCRV) 和鲤春病毒血症病毒 (spring viremia of carp virus, SVCV) 感染后, bc Viperin m RNA在上述组织中的表达水平提高.在青鱼尾鳍 (Mylopharyngodon piceus fin, MPF) 细胞中, bc Viperin m RNA表达水平同样会在GCRV和SVCV感染后发生上升.蛋白质免疫印迹表明bc Viperin蛋白的相对分子质量约为42 k D;He La和EPC细胞中的免疫荧光染色实验表明bc Viperin是细胞质蛋白.编码bc Viperin的质粒在EPC细胞中过表达后能够显著提高细胞抵御SVCV和GCRV的抗病毒能力.以上研究表明bc Viperin是青鱼天然免疫过程中重要的抗病毒蛋白质.

补体(Complement)是存在于动物体液中及细胞表面,经活化后可介导免疫和炎症反应的蛋白.本研究采用RACE技术首次从团头鲂(Megalobrama amblycephala) cDNA文库中克隆出C3和C9基因cDNA全长序列(MaC3和MaC9),并运用qRT-PCR技术检测了MaC3和MaC9基因在团头鲂不同组织中的表达情况和饥饿胁迫后在肝脏中的时序表达模式.结果 显示,MaC3和MaC9基因序列全长分别为5 378 bp和2 522 bp,5'UTR长为316 bp和8bp,YUTR长为133bp和480 bp,开放阅读框为4 929 bp和2 034 bp,分别编码1 642和677个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明,MaC3和MaC9分别与鲫鱼(Carassius auratus)补体C3和草鱼(Ctenopharyngodon idella)补体C9相似度较高,分别达78％和84％.实时荧光定量结果表明,MaC3和MaC9在脑、肝脏、脾脏、头肾、中肾、心脏、前肠、中肠、后肠、鳃、肌肉组织中均有表达且在肝脏中表达量最高,分别在肾脏和心脏中表达量最低.在实验周期21d和28 d,持续饥饿组团头鲂肝脏中补体C3和C9基因的表达量显著低于对照组(p＜0.05),但饥饿过量投喂组团头鲂C3和C9基因表达量显著高于对照组(p＜0.05),饥饿再投喂组的C3和C9基因表达量与对照组差异不显著.持续饥饿组的团头鲂肝细胞中细胞核模糊变形并且肝血窦扩张,有明显的炎症反应.研究结果表明,长期饥饿胁迫下团头鲂肝损伤且补体合成能力下降,导致团头鲂机体免疫应答受到抑制作用,本研究为团头鲂免疫防御系统的研究提供了重要资料.

热休克蛋白27 (Hsp27)是一种小分子热休克蛋白,具有分子伴侣性质,能够与肌动蛋白结合,从而调节肌动蛋白细胞骨架重组.本试验通过cDNA末端快速扩增法(RACE)获得草鱼Hsp27基因全长序列,进行氨基酸序列预测,蛋白质特征分析,以及Hsp27基因的组织差异表达,并检测了草鱼摄食蚕豆过程中Hsp27基因表达量的变化.结果 表明:草鱼Hsp27基因cDNA序列全长1 271 bp,含417 bp的5'端非编码区、317 bp的3'端非编码区和537 bp的开放阅读框,编码178个氨基酸.所编码的氨基酸序列与鲫鱼(Carassius auratus)、斑马鱼(Danio rerio)、斑点叉尾鮰(Ietalurus punetaus)和墨西哥脂鲤(Astyanax mexicanus)的同源性分别达83％、76％、75％、70％.草鱼Hsp27蛋白分子质量为19 501.39 Da,含178个氨基酸残基,理论等电点为6.20,为亲水性蛋白,不含信号肽;其二级结构和三级结构显示有螺旋和折叠.草鱼Hsp27基因在肝脏、脾脏、脑、肾脏、鳃、肌肉、心脏、皮肤、前肠、血液中均有表达,在心脏和肌肉组织中高表达,肾脏组织表达量最低(p＜0.05).相比对照组,摄食蚕豆后草鱼心脏组织和肌肉组织Hsp27基因的表达量显著升高,表明蚕豆促进了Hsp27的表达,所得结果为后续研究蚕豆脆化草鱼肌原纤维变化的分子机理奠定基础.

为了研究草鱼BCL10基因在草鱼出血病中的应答机制,文章克隆了BCL10基因,并利用生物信息学、荧光定量和血涂片等技术对其进行了分析.生物信息学结果显示,BCL10基因开放阅读框为738 bp,编码245个氨基酸.实时荧光定量PCR结果显示,感染病毒后草鱼体内BCL10表达量持续上调,在肝胰腺和中肾中第4天达到峰值,第7天表达量开始下调.血涂片显微镜观察发现了血液中淋巴细胞在感染病毒后第1到第4天下降,第7天时上升.肾脏的组织病理学观察也发现中肾中肾小管上皮细胞第1到第7天逐渐空泡化,脱落坏死.以上结果表明,BCL10基因参与了草鱼应对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)入侵的免疫应答.