呼吸道合胞病毒(RSV)是儿童和老年人呼吸道疾病的常见病因,这种病毒的毒力与机体的免疫应答(尤其是I型IFN的产生)一定程度上共同决定了呼吸道疾病的严重程度. 本研究使用蛋白质组学技术,在RSV感染的细胞中瞬时表达基质蛋白M,鉴定发现了许多与M蛋白相互作用的伴侣蛋白.

目的:观察外源性miR-146a-5p对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠胚胎吸收和胎鼠发育不良的改善作用，并初步探讨其作用机制。方法:①将36只成年雌鼠与雄鼠交配，分别于交配前（D0/未孕）、孕第0.5天（day 0.5，D0.5，即见栓当日）、孕第4.5天（day 4.5，D4.5）、孕第7.5天（day 7.5，D7.5）、孕第9.5天（day 9.5，D9.5）和孕第13.5天（day 13.5，D13.5）收集小鼠子宫组织，通过实时荧光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）和Western blotting检测不同妊娠期小鼠子宫组织中miR-146a-5p及其靶基因TRAF6蛋白的表达水平；②对孕D7.5小鼠腹腔分别注射生理盐水（对照，记为COL组）、LPS 250 μg/kg（记为LPS250组）、LPS合并尾静脉注射10 nmol miR-146a-5p无关序列（negative control，NC，记为LPS250+NC组）、LPS合并尾静脉注射10 nmol miR-146a-5p激动剂（miR-146a-5p agomir，记为LPS250+miR-146a-5p agomir组），孕第8.5天（day 8.5，D8.5）对小鼠宫内总胚胎数和吸收胚胎数进行计量分析，通过qPCR和Western blotting分别检测子宫组织中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNFα）mRNA和TRAF6蛋白表达水平；③将LPS剂量减为50 μg/kg后，将孕D7.5小鼠分为2组，每组3只：一组腹腔注射100 μL LPS（50 μg/kg），同时鼠尾静脉注射10 nmol 的无关序列，记为LPS50+NC组；另一组行腹腔注射100 μL LPS（50 μg/kg），同时鼠尾静脉注射10 nmol 的miR-146a-5p agomir，记为 LPS50+miR-146a-5p agomir组，孕第16.5天（day 16.5，D16.5）对小鼠宫内总胎数/胚胎数、吸收胚胎数、存活胎数及存活胎鼠重量和胎盘重量进行计量分析；④分离培养原代小鼠骨髓源性巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMDM），利用LPS刺激诱导其M1极化，再瞬时转染miR-146a-5p模拟物（miR-146a-5p mimics）或其NC片段后，通过qPCR和Western blotting分别检测细胞中 TNFα mRNA和pSTAT1蛋白表达水平。 结果:miR-146a-5p在孕D7.5、D9.5和D13.5小鼠子宫植入部位的表达水平显著高于非植入部位（ P=0.013、 P=0.012、 P=0.003），TRAF6蛋白在D13.5植入部位的表达水平显著低于非植入部位（ P=0.012）。对孕D7.5小鼠腹腔注射250 μg/kg LPS后，孕D8.5时LPS250组的胚胎吸收率为43.13%±3.31%，显著高于COL组（0%， P=0.002），而LPS250+miR-146a-5p agomir组的胚胎吸收率（13.50%±0.87%）显著低于LPS250+NC组（59.33%±4.04%， P=0.001）。当对孕D7.5小鼠腹腔注射低剂量LPS（50 μg/kg）后，D16.5时LPS50+miR-146a-5p agomir组存活胎鼠重量［（0.29±0.09）g］及胎盘重量［（0.06±0.02）g］均显著高于LPS50+NC组［（0.46±0.06）g， P<0.001；（0.07±0.02）g， P=0.021］，两组间吸收胚胎数及胚胎吸收率差异均无统计学意义（均 P>0.05）。与转染NC的BMDM细胞相比，转染miR-146a-5p mimics的BMDM细胞中，pSTAT1蛋白和 TNFα mRNA的表达水平都显著下调（ P=0.012、 P=0.039）。 结论:miR-146a-5p在小鼠胚胎植入后期及胎盘发育期母-胎界面的表达水平显著增高，外源性miR-146a-5p能有效改善LPS诱导的小鼠胚胎吸收和胎鼠发育不良，miR-146a-5p能抑制小鼠巨噬细胞的M1极化活性，提示miR-146a-5p可能通过抑制小鼠母-胎界面巨噬细胞的M1极化而保障妊娠的正常建立和维持。

目的:明确1个多发性骨骺发育不良(MED)家系的基因变异及遗传学病因。方法:选取2020年9月13日于首都医科大学附属北京积水潭医院就诊的1个MED家系作为研究对象。收集该家系的临床资料，采集家系成员的外周血样，提取基因组DNA。对先证者进行全外显子组测序(WES)和生物信息学分析，确定变异位点，并通过Sanger测序法进行家系验证。分别构建 SLC26A2基因野生型和变异型表达质粒，瞬时转染人原代软骨细胞，应用免疫荧光技术与CCK8试剂检测变异对于蛋白定位和细胞增殖的影响。 结果:WES与PCR-Sanger检测发现先证者携带 SLC26A2基因复合杂合变异：c.484G>T(p.Val162Leu)和c.485_486delTG(p.Val162Glyfs*12)，分别遗传自其父亲与母亲。免疫荧光检测结果显示变异型SLC26A2 Val162Leu和SLC26A2 Val162Glyfs*12蛋白在人原代软骨细胞的细胞核和细胞质中均有分布，细胞增殖检测结果显示变异型SLC26A2 Val162Leu和SLC26A2 Val162Glyfs*12蛋白均能减少人原代软骨细胞的增殖。 结论:SLC26A2基因c.484G>T和c.485_486delTG变异均可影响人原代软骨细胞的增殖，可能是导致先证者患MED的遗传学病因。

目的:评价瞬时受体电位香草酸4(TRPV4)在右美托咪定改善机械通气致脑损伤小鼠认知功能降低中的作用。方法:清洁级健康雄性C57BL6小鼠90只，体质量20~25 g，8~12周龄，采用随机数字表法分为5组( n＝18)：对照组(C组)、机械通气组(V组)、HC-067047组(H组)、右美托咪定组(D组)和右美托咪定+GSK1016790A组(DG组)。C组不行机械通气，自主呼吸空气6 h；V组机械通气6 h；H组机械通气3和6 h时分别脑室内注射TRPV4阻断剂HC-067047 10 mmol；D组和DG组机械通气前30 min腹腔注射右美托咪定50 μg/kg；DG组机械通气前60 min脑室内注射TRPV4激动剂GSK1016790A 5 μmol。每组随机取6只小鼠分别于机械通气前1 d、机械通气后3和7 d时行Morris水迷宫实验。机械通气后1 d，每组随机处死6只小鼠取脑组织，采用TUNEL法检测海马CA1区神经元凋亡情况，计算凋亡指数。每组随机处死6只小鼠取海马组织，采用Western blot法检测TRPV4、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)、p-Akt、Bcl-2、Bax和caspase-3的表达。 结果:与C组比较，V组和DG组机械通气后3和7 d逃避潜伏期延长，穿越原平台位置次数减少，海马TRPV4和caspase-3表达上调，p-Akt表达下调，Bcl-2/Bax比值降低，神经元凋亡指数升高( P<0.05)；与V组比较，D组和H组机械通气后3和7 d逃避潜伏期缩短，穿越原平台位置次数增加，海马TRPV4和caspase-3表达下调，p-Akt表达上调，Bcl-2/Bax比值升高，神经元凋亡指数降低( P<0.05)；与D组比较，DG组机械通气后3和7 d逃避潜伏期延长，穿越原平台位置次数减少，海马TRPV4和caspase-3表达上调，p-Akt表达下调，Bcl-2/Bax比值降低，神经元凋亡指数升高( P<0.05)。 结论:TRPV4参与了右美托咪定改善机械通气致脑损伤小鼠认知功能降低的过程，与其上调p-Akt表达，抑制海马神经元凋亡有关。

目的:探讨瞬时感受器电位离子通道香草素受体4(TRPV4)在睾丸缺血再灌注损伤(IRI)中对GC-1细胞增殖和凋亡的作用及其机制。方法:建立睾丸GC-1细胞缺氧复氧模型，采用蛋白质印迹法(Western blot)检测不同复氧损伤时间点TRPV4的表达变化；分别采用噻唑蓝(MTT)实验、流式细胞术检测转染TRPV4对GC-1细胞增殖和凋亡的影响；采用Western blot法检测睾丸组织中转染TRPV4对GC-1细胞中半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3和细胞色素C(Cyt-C)表达的影响，组间比较采用 t检验，多组间比较采用单因素方差分析。 结果:对照组及缺氧复氧组(0、6、12、24、48和72 h)TRPV4的蛋白表达水平分别为0.19±0.02、0.35±0.03、0.42±0.04、0.46±0.04、0.62±0.05、0.54±0.05、0.45±0.04。缺氧复氧组TRPV4表达显著高于未缺氧GC-1细胞的对照组，并在复氧24 h达到峰值( F＝6.898， P<0.05)，差异有统计学意义；缺氧复氧组中细胞增殖水平明显低于对照组(52.32±4.58比100.00±7.63， t＝-9.280， P<0.05)，差异有统计学意义，细胞凋亡水平高于对照组(15.60±1.72比4.08±0.87， t＝10.352， P<0.05)，差异有统计学意义；过表达TRPV4组中细胞增殖水平低于其对照组(23.65±3.98比51.35±4.67， t＝-7.820， P<0.05)，差异有统计学意义，细胞凋亡水平高于其对照组(26.93±2.15比14.62±1.68)， t＝7.814， P<0.05)，差异有统计学意义；沉默TRPV4组中细胞增殖水平高于其对照组(72.49±6.21比53.18±5.14， t＝4.150， P<0.05)，差异有统计学意义，细胞凋亡水平低于其对照组(9.71±1.25比15.07±1.64， t＝-4.502， P<0.05)，差异有统计学意义。缺氧复氧组中Caspase-3和Cyt-C表达水平高于对照组(0.70±0.06比0.20±0.02， t＝13.693， P<0.05；0.74±0.07比0.26±0.03， t＝10.917， P<0.05)，差异有统计学意义；过表达TRPV4组中Caspase-3和Cyt-C表达水平高于其对照组(1.25±0.11比0.69±0.07， t＝7.439， P<0.05；1.38±0.14比0.72±0.07， t＝7.303， P<0.05)，差异有统计学意义；沉默TRPV4组中Caspase-3和Cyt-C表达水平低于其对照组(0.46±0.05比0.68±0.06， t＝-4.879， P<0.05；0.45±0.05比0.72±0.06， t＝-5.988， P<0.05)，差异有统计学意义。 结论:TRPV4在GC-1细胞中高表达，其可能通过改变GC-1细胞的增殖和凋亡能力，从而影响睾丸IRI的发生发展。

目的:探讨瞬时受体电位M8（TRPM8）对间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（IC/BPS）小鼠疼痛症状及神经元增殖的影响。方法:将雌性野生型C57BL/6小鼠（8~10周龄）按随机数字表法分为对照组、IC/BPS模型组和IC/BPS模型+薄荷醇组（各6只）；TRPM8基因敲除小鼠随机分为TRPM8基因敲除组和TRPM8基因敲除模型组（各6只）。IC/BPS模型组、IC/BPS模型+薄荷醇组和TRPM8基因敲除模型组小鼠皮下注射尿路斑块蛋白65-84氨基酸残基（UPK3A65-84）多肽；IC/BPS模型+薄荷醇组继续注射薄荷醇。建模成功后，通过机械敏感性评估各组疼痛阈值的差异；膀胱壁注射细胞膜红色荧光探针（Dil），10 d后采集背根神经节（DRG）组织，利用Western蛋白印迹法和实时定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分别检测各组TRPM8和生长相关蛋白43（GAP43）的蛋白质和mRNA含量的差异；免疫荧光技术检测DRG组织中TRPM8表达与GAP43或Dil的分布情况。分析TRPM8与IC/BPS小鼠疼痛症状的关系及在神经元增殖中的作用。结果:模型均构建成功。与对照组相比，IC/BPS模型组和IC/BPS模型+薄荷醇组小鼠的疼痛阈值均降低［分别为（8.50±1.22）、（5.50±1.05）比（11.67±2.16），均 P<0.001］。与对照组相比，IC/BPS模型组和IC/BPS模型+薄荷醇组TRPM8的表达量均升高，而在TRPM8基因敲除组小鼠中TRPM8未表达［分别为（3.16±0.05）、（6.46±0.21）、0比（1.00±0.06），均 P<0.001］。各组小鼠TRPM8蛋白表达量与mRNA表达趋势相同（ P<0.001）。与对照组相比，IC/BPS模型组和IC/BPS模型+薄荷醇组DRG中GAP43 mRNA的表达增加，而TRPM8基因敲除模型组的表达下降（均 P<0.001）。GAP43蛋白表达与mRNA表达趋势相同（ P<0.001）。免疫荧光结果显示，与对照组相比，IC/BPS模型组和IC/BPS模型+薄荷醇组DRG中GAP43阳性神经元的数量增加，TRPM8基因敲除组下降（均 P<0.001）。与对照组相比，IC/BPS组和IC/BPS模型+薄荷醇组DRG Dil阳性感觉神经元数量增加，而TRPM8基因敲除组下降（均 P<0.001）。 结论:TRPM8可加剧IC/BPS小鼠的疼痛症状，其机制可能与诱导DRG水平的感觉神经增殖有关。

目的:评价miR-21在脓毒症大鼠肺损伤中的作用及其与瞬时受体电位M2(TRPM2)表达的关系。方法:清洁级健康Wistar大鼠48只，雌雄各半，体重250～300 g，采用随机数字表法分为4组( n＝12)：假手术组(SH组)、脓毒症组(S组)、miR-21抑制剂组(MI组)和miR-21抑制剂＋TRPM2阻断剂Gd3 ＋组(MIG组)。采用盲肠结扎穿孔(CLP)法制备大鼠脓毒症模型。于CLP前12 h，MI组和MIG组分别尾静脉注射miR-21抑制剂和miR-21抑制剂＋TRPM2阻断剂组Gd3 ＋。于CLP后24 h时取颈动脉血样，行血气分析，记录PaO 2，计算氧合指数；随后处死大鼠取肺组织，光镜下行肺损伤评分，确定湿重/干重(W/D)比值，采用qRT-PCR法检测miR-21和TRPM2的mRNA表达，分光光度计比色法检测MDA和SOD水平，ELISA法检测血清IL-6、IL-8和TNF-α的浓度。 结果:与SH组比较，其余3组氧合指数和肺组织SOD活性降低，肺组织W/D比值、肺损伤评分、MDA含量、血清IL-6、IL-8和TNF-α浓度升高，S组肺组织miR-21 mRNA表达上调，TRPM2 mRNA表达下调( P<0.05)；与S组比较，MI组氧合指数、肺组织SOD活性和血清IL-6、IL-8和TNF-α浓度升高，肺组织W/D比值、肺损伤评分、MDA含量降低，MI组和MIG组肺组织miR-21 mRNA表达下调，TRPM2 mRNA表达上调( P<0.05)；与MI组比较，MIG组氧合指数和肺组织SOD活性降低，肺组织W/D比值、肺损伤评分、MDA含量和血清IL-6、IL-8和TNF-α浓度升高，肺组织TRPM2 mRNA表达下调( P<0.05)。 结论:miR-21表达上调，TRPM2表达下调参与了脓毒症大鼠肺损伤的过程。

目的:探讨微小RNA(miRNA，miR)-630对膀胱尿路上皮癌侵袭转移的调控作用及其分子机制。方法:通过生物信息学预测，APC膜募集蛋白(Amer2)为miR-630下游靶基因。构建含miR-630结合位点的Amer2基因3’端非编码区(3’UTR)荧光素酶报告载体，检测miR-630与Amer2的3’UTR相互作用对荧光素酶活性的影响。miR-630模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitor)用脂质体(Lipofectamine) 2000在体外瞬时转染膀胱癌细胞株EJ，转染72 h后采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测Amer2、鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF-H1)的表达；蛋白质印迹法(Western blot)检测Amer2、GEF-H1蛋白的表达变化；细胞划痕实验、Transwell小室体外侵袭实验反映细胞增殖、转移潜能的变化，组间比较采用两独立样本 t检验。 结果:转染miR-630 mimics后，Amer2荧光海肾素酶活性低于对照组，差异有统计学意义(13.885±1.624比22.182±1.354， t＝-6.885， P<0.05)；转染miR-630 mimics后，膀胱癌细胞株EJ中Amer2的表达量明显低于对照组(11.786±4.123比8.327±3.863， t＝5.780， P<0.05)，差异有统计学意义，实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)及Western blot结果显示GEF-H1基因及蛋白的表达水平明显高于对照组(9.886±5.422比13.565±4.476， t＝5.420， P<0.05)，差异有统计学意义；转染miR-630 inhibitor后，体外实验表明膀胱癌细胞的迁移活性[(42.320±4.183)%比(35.528±5.433)%， t＝5.825]和侵袭能力[(49.180±5.677)%比(40.422±6.266)%， t＝7.377， P<0.05]明显低于对照组，差异有统计学意义。 结论:MiR-630在膀胱尿路上皮癌中高表达，可能通过调控Amer2/GEF-H1通路增强肿瘤细胞增殖，诱导膀胱癌细胞侵袭转移。

目的:制备1株靶向甲型流感病毒N1亚型神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的功能性抗体FNA1，并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)序列信息，合成FNA1重链以及轻链可变区序列，连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ，构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FNA1。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FNA1。ELISA检测FNA1与甲型流感病毒N1亚型NA抗原的结合，流式细胞术分析FNA1与细胞膜表面表达N1亚型NA抗原的结合。通过抗体抑制NA蛋白活性试验检测抗体FNA1的体外功能活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FNA1。FNA1特异性识别结合N1亚型的NA抗原，且呈浓度依赖效应。FNA1能通过结合细胞膜表面表达的N1亚型NA蛋白，有效阻断细胞膜表面的NA活性，从而抑制包装的假病毒从细胞表面释放，继而抑制进一步的靶细胞感染。结论:获得1株具有体外功能活性的靶向甲型流感病毒N1亚型NA蛋白的抗体FNA1。

目的:对1个遗传性抗凝血酶（AT）缺陷症患者所携带的复合杂合突变进行分子机制研究。方法:先证者因“突发晕厥并四肢抽搐一天”于2018年11月就诊于温州医科大学附属第一医院。采集先证者及其家系成员（共3代9人）外周静脉血并进行家系调查。采用发色底物法检测AT活性（AT：A），免疫比浊法检测AT抗原（AT：Ag）。对SERPINC1基因进行直接测序以确定突变位点。利用多种计算机工具预测突变的保守性和疏水性变化。构建重组质粒表达载体并瞬时转染HEK293T细胞以进行体外过表达研究。采用Western Blotting、ELISA和细胞免疫荧光实验对重组AT蛋白进行体外表征。结果:先证者为一例21岁男性。AT：A为 33%，AT：Ag同步下降，属于Ⅰ型AT缺陷症。基因分析显示先证者在第2和第5外显子分别携带c.318_319insT（p.Asn107*）杂合插入突变和c.922G>T（p.Gly308Cys）杂合错义突变。该两个突变位点在同源物种中均完全保守；疏水性分析表明，p.Gly308Cys突变可能降低氨基酸残基307-313的亲水性。体外表达显示，重组蛋白AT-G308C在转染细胞裂解液和培养上清中的含量分别降低至46.98%±2.94%和41.35%±1.48%；经蛋白酶体抑制剂（MG132）处理后，Western Blotting分析显示在细胞质中的AT-G308C蛋白量恢复到与野生型相似的水平；在细胞裂解液和培养上清中均未检测到重组蛋白AT-N107*。结论:p.Asn107*杂合插入突变和p.Gly308Cys杂合错义突变与该家系先证者AT水平降低有关。p.Asn107*杂合插入突变可能触发无义突变介导的mRNA降解，从而消除异常转录本；p.Gly308Cys杂合错义突变可能通过改变局部残基的疏水性导致AT蛋白在细胞质中发生蛋白酶体依赖性降解。