目的 基于c-jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路探讨儿茶素对对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)诱导肝损伤的作用及机制.方法 ICR小鼠随机分为对照组、模型组以及儿茶素(50、100mg/kg)组,小鼠连续3dig儿茶素,末次给予儿茶素1h后ip APAP(400mg/kg),6h后采用苏木素-伊红(HE)染色评估小鼠肝脏组织病变,检测血清中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)活性及肝脏中谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性;考察儿茶素对细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)代谢酶活性的影响.人正常肝细胞L02给予40、80 μmol/L儿茶素,15 min后给予15 mmol/L APAP孵育6 h,检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、线粒体膜电位变化、线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)含量、胞质B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X protein,Bax)、第2个线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激活剂(second mitochondria-derived activator of caspases,Smac)、凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)蛋白表达以及线粒体动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)、线粒体融合蛋白2(mitofusin2,Mfn2)、Bax蛋白表达和p-JNK、JNK蛋白表达.给予JNK激活剂后,考察儿茶素对APAP诱导的肝细胞损伤作用.结果 儿茶素显著降低APAP诱导的肝损伤小鼠血清中ALT、AST活性(P＜0.05、0.01),显著升高肝脏GSH水平和SOD活性(P＜0.05、0.01),改善肝脏损伤.儿茶素显著升高APAP处理的L02细胞存活率、线粒体膜电位、呼吸链复合物Ⅰ活性和ATP水平(P＜0.05、0.01),显著降低ROS水平(P＜0.05),显著下调线粒体中Drp1、Bax和胞质中Smac、AIF蛋白表达(P＜0.05),显著上调线粒体中Mfn2和胞质Bax的蛋白表达(P＜0.05),并抑制JNK的磷酸化水平(P＜0.05).给予JNK激活剂后,儿茶素的抗氧化作用和对肝脏的保护作用明显减弱(P＜0.05、0.01).结论 儿茶素通过抑制JNK信号通路减轻线粒体氧化应激,进而拮抗APAP诱导的肝损伤.

目的 探讨微小核糖核酸-134(miR-134)在癫痫持续状态发生中的作用.方法 ①构建大鼠miR-134抑制慢病毒载体;②建立大鼠氯化锂-匹罗卡品癫痫持续状态模型,观察miR-134抑制对大鼠发作潜伏期,癫痫持续状态时间,发作严重程度,脑电图功率以及海马神经元凋亡的影响.结果 ①将一段362 bp的包含2个miR-134竞争结合位点的脱氧核糖核酸(DNA)片段经XhoI和EcoRI酶切后插入质粒pCDH-CMV-MCS-EG(R) FP-MCS中EG(R) FP序列的下游,该片段转录产物与miR-134互补形成稳定的复合物,从而阻止了miR-134对靶信使核糖核酸(mRNA)的降解或翻译抑制,得到大鼠miR-134抑制慢病毒载体.②立体定向注射miR-134抑制慢病毒于大鼠海马并放置海马电极,2w后建立氯化锂-匹罗卡品大鼠癫痫持续状态模型,进行脑电图监测,结果提示miR-134抑制慢病毒组较相应对照病毒组V级发作潜伏期延长(P＜0.01),脑电图总功率降低(P＜0.001),癫痫持续状态时间缩短(P＜0.05).癫痫持续状态后3d制备脑片进行免疫荧光染色,结果提示miR-134抑制慢病毒组海马齿状回(DG)、CA1及CA3区较相应对照病毒组神经元核(NeuN)染色阳性细胞数增多,末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记(TUNEL)阳性细胞减少.结论 抑制大鼠海马miR-134能够减轻癫痫持续状态发作并具有神经保护作用.

端粒是稳固真核生物染色体末端、保护遗传信息完整的必要组分,端粒酶、端粒蛋白复合物(shelterin)等与端粒相互作用的蛋白因子,均参与端粒结构和功能的维持.其中,shelterin复合物可通过特异结合到端粒区,帮助端粒成帽,在调控端粒长度、维护端粒结构和功能完整性方面发挥重要作用.Shelterin复合物6种核心蛋白组分的结构及其端粒维护功能的研究,对端粒生物学、端粒相关的退行性疾病研究具有重要意义,各组分表达异常或结构改变与端粒功能失调、细胞衰老加速相关,将导致基因组不稳定性以及疾病发生.本文对shelterin复合物的结构和各组分的功能研究进展进行综述.

目的:探讨达拉菲尼对小鼠肾脏缺血再灌注损伤(IRI)的保护作用及机制. 方法:将24只C57BL/6小鼠随机分为4组:假手术组(sham组);缺血再灌注组(IRI组),夹闭双侧肾蒂30 min再灌注24h;达拉菲尼组(DAB组),仅与IRI组在相同时间灌胃给予相同量的达拉菲尼;达拉菲尼预处理+缺血再灌注组(DAB+IRI组),灌胃给予达拉菲尼2h后进行IRI造模,每组6只.收集小鼠IRI 24h后的血清及肾脏组织.采用相应试剂盒检测各组肾功能血清肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)水平,HE及PAS染色比较各组肾脏病理学改变,Western Blot及qRT-PCR检测肾小管损伤标志物中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和肾损伤分子1(KIM-1)的蛋白及mRNA水平,qRT-PCR检测炎症因子白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA水平,免疫组织化学染色检测肾脏组织中TNF-α蛋白表达,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测肾组织细胞死亡情况,Western Blot检测肾脏组织中程序性坏死(necroptosis)通路相关的受体相互作用蛋白1(RIP1)、受体相互作用蛋白3(RIP3)、磷酸化的受体相互作用蛋白3(pRIP3)、混合系列蛋白激酶复合物(MLKL)、磷酸化的混合系列蛋白激酶复合物(pMLKL)蛋白水平. 结果:与sham组相比,IRI组SCr、BUN水平升高(P＜0.05),肾组织病理损伤严重,小管损伤标志物NGAL和KIM-1蛋白和mRNA水平升高,炎症因子IL-6以及TNF-α mRNA含量增加,肾脏组织TNF-α蛋白表达升高,肾脏组织细胞死亡增多,RIP1、RIP3、pRIP3、MLKL以及pMLKL蛋白表达增加;与IRI组比较,DAB+IRI组减轻肾功能、肾组织损伤,减少NGAL、KIM-1的蛋白和mRNA表达水平,下调IL-6和TNF-αmRNA水平,减少肾脏组织中TNF-α蛋白表达,抑制RIP3、pRIP3及pMLKL的蛋白表达(P均＜0.05),而RIP1和MLKL蛋白改变不明显.DAB组与sham组间各指标无统计学差异. 结论:达拉菲尼通过抑制RIP3介导的程序性坏死从而对小鼠肾脏缺血再灌注损伤起保护作用.

目的 关于异常寡核苷酸结合折叠域蛋白基因(OBGs)通过微小染色体维持(MCM)复合物影响肝细胞癌DNA复制起始的报道较少.文中旨在探讨逆转录相关基因(RTGs)在肝细胞癌中的作用及可变剪接和单核苷酸位点变异(SNV)与基因表达异常的相关性. 方法 选取150只洁净级昆明小鼠,采用随机数字表法取100只,双前肢腋下注射对数生长期肝细胞癌细胞株H22等渗盐水悬液作为H22组,余50只注射0.2 mL不含H22的等渗盐水作为对照组.从H22组小鼠中选出成瘤小鼠,解剖取出瘤体,从对照组小鼠中取健康肝组织.提取H22组和对照组总RNA,分析差异表达基因.筛选差异表达的逆转录相关DEGs(RDEGs),对RDEGs进行GO和KEGG分析.对RDEGs编码蛋白进行互作分析,对RDEGs多态性与基因表达进行相关性分析. 结果 肝细胞癌中有193个差异表达的RTGs,共参与2个生物学程序、3个细胞组分、1个分子功能、3个信号通路和3个功能部位;其功能主要集中在DNA复制,尤其复制起始中OBGs参与的MCM复合体及端粒复合体构建.可变剪接分析结果显示,4个RDEGs在基因的3个位点发生了差异表达的可变剪接,且可变剪接与相应基因的表达呈正相关.SNV和INDEL分析显示肝细胞癌组织中共有157个RDEGs,发生1541个SNV和78个INDEL位点的改变;上述基因位点的改变主要发生在基因的6个部位,即外显子区、内含子区、基因间区、基因下游区、基因上游区和拼接区;共有28个基因的SNV改变差异有统计学意义(P<0.05).基因位点多态性分析结果显示,5个OBGs在肝细胞癌中出现了SNV现象,而健康肝组织中则没有SNV. 结论 RTGs中的OBGs可能在肝细胞癌中通过自身的基因多态性突变引起MCM复合体及端粒复合体的改变,从而调控DNA复制起始及保护端粒的完整性,进而在癌细胞的增殖过程中发挥重要作用.可变剪接及SNV则可能是一些基因表达的重要调控因素.

端粒是染色体末端的核蛋白结构.染色体末端重复的端粒DNA可以规避不适当的DNA损伤反应(DNA damage response,DDR)的激活,维持染色体的稳定性,端粒的缺失会引起染色体融合并导致细胞的衰老及死亡.端粒特异性蛋白复合物Shelterin在保护端粒完整性方面具有重要作用.在这个复合体中,端粒结合因子2 (telomeric-repeat binding factor 2,TRF2)在维持端粒稳定、防止端粒染色体末端融合以及端粒染色体复制过程中发挥关键作用.该文综述了TRF2介导的保护染色体末端的多方面的机制.

端粒酶是一种具有逆转录活性的核糖核蛋白,由非编码RNA模板(端粒酶RNA成分,telomerase RNA template component,TERC)和蛋白成分共同构成,能在酶亚基(端粒酶逆转录酶,telomerase reverse transcriptase,TERT)作用下,从头合成端粒DNA序列[1].人类胚胎发育早期,很多组织可检测到端粒酶活性,但妊娠12～18周时发生了转录沉默,随着人类组织和细胞分化,端粒酶活性迅速降低.从机制上讲,除少部分通过端粒的替代性延长(altemative lengthening of telomeres,ALT)机制[2],缺乏TERT/端粒酶活性无法维持细胞持续增殖所需的端粒长度,严重缩短的端粒会触发端粒功能障碍并激活DNA损伤反应途径,从而导致细胞生长停滞.

端粒是位于染色体末端的特殊核蛋白复合物,其高度保守的重复序列和蛋白复合物形成保护环结构,以维持线性染色体的稳定性和完整性.端粒酶通过添加富含鸟嘌呤的重复序列,在维持和调节端粒长度、细胞永生性和衰老中起着重要作用.通过研究病变细胞的端粒长度变化趋势和端粒酶活性,可为选择端粒酶作为治疗癌症的标记物提供理论参考.本文针对端粒、端粒酶的结构和日常作用机理,以及它们在肝细胞癌中的研究进展进行综述,以期有助于恶性肿瘤和代谢性疾病的预防、诊断和治疗.

目的 ·通过电子显微镜(电镜)和负染技术分析裂殖酵母端粒结合蛋白质Shelterin五元复合物(Rap1-Poz1-Tpz1-Ccq1-Pot1)的三维结构.方法 ·利用大肠埃希菌表达系统在体外重组和表达带有组氨酸-小分子泛素相关修饰物蛋白(histidine-small ubiquitin related modifier,His-SUMO)和谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase,GST)纯化标签的目的蛋白质,通过两步亲和层析(镍离子金属螯合亲和层析、谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析)以及一步凝胶过滤层析(SuperoseTM610/300 GL)分离纯化目的蛋白质复合物.采用0.75％甲酸双氧铀对蛋白质样品进行染色,用120 kV透射电镜观察,放大倍数设置为92000倍,收集颗粒分散性较好的负染照片.用EMAN2软件和Relion3.0软件,通过单颗粒重构技术研究裂殖酵母Shelterin复合物的三维结构,最后利用UCSF Chimera软件对裂殖酵母Shelterin复合物的重构模型进行分析.结果 ·经过两步亲和层析以及凝胶过滤层析获得纯度高、组分齐、均一性良好的重组裂殖酵母Shelterin五元复合物的蛋白质样品;利用120 kV透射电镜获得负染电镜照片83张,从中挑选18659个蛋白质复合物颗粒进行三维模型构建,初步解析了该复合物的三维结构;将重构模型与已报道的蛋白质组分的高分辨率结构进行分子对接,确定各组分在复合物中的定位情况,揭示该复合物以二聚体的形式存在.结论 ·构建了裂殖酵母Shelterin五元复合物(Rap1-Poz1-Tpz1-Ccq1-Pot1)的低分辨率的三维模型.

端粒是保护线性染色体末端的核酸-蛋白复合物.与常见的真核生物短重复序列组成的端粒不同,黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)端粒DNA由反转座子组成,其转座行为被果蝇宿主严格限制在端粒,既实现延长端粒的功能,也减少转座子跳跃对基因组的损伤.但果蝇宿主是如何完成如此精确调控的机制尚不明确.目前已知的全基因组范围抑制转座子表达包括H3K9me3参与的异染色质形成途径和piRNA路径,而近期研究发现果蝇端粒保护蛋白参与端粒反转座子的特异调控.本文主要综述了端粒保护蛋白在调控端粒转座子中的具体功能.对果蝇端粒转座子调控的研究有利于更好地理解宿主与转座子协同进化的分子机制.