目的:探讨达拉菲尼治疗皮肤黑色素瘤（CMM）的效果及其对垂体同源框1（PITX1）蛋白表达的影响。方法:选取武汉市第一医院2016年11月至2017年12月收治的86例CMM患者为研究对象，采用随机数字表法分为观察组和对照组各43例，对照组行化疗，观察组在对照组化疗方案基础上加用达拉菲尼。采用免疫组织化学法检测两组患者PITX1蛋白表达情况。比较两组治疗效果、复发率、生存情况、PITX1阳性表达率及不良反应发生情况。结果:观察组治疗有效率高于对照组[46.51%（20/43）比25.58%（11/43）]，差异有统计学意义（ χ2=3.23， P=0.043）；观察组疾病控制率高于对照组[93.02%（40/43）比72.09%（31/43）]，差异有统计学意义（ χ2=5.17， P=0.023）。与对照组比较，观察组总生存、无进展生存均更好，复发率更低，PITX1阳性表达率更高（均 P<0.05）。观察组不良反应发生率低于对照组[11.63%（5/43）比32.56%（14/43）]，差异有统计学意义（ χ2=5.47， P<0.05）。 结论:达拉菲尼治疗CMM效果较好，可提高PITX1蛋白表达水平，降低复发率及不良反应发生率，并延长患者生存时间。

目的:通过建立肝癌患者来源的异种移植瘤模型(PDX)探究肝癌索拉菲尼敏感性相关的长链非编码RNA(lncRNA)。方法:选取上海市第一人民医院2021年5月至2022年10月的17例肝癌标本建立PDX模型。PDX模型传代14 d后通过随机数表法分为对照组与索拉菲尼给药组。给药21 d，观察7 d后收取肿瘤组织，给药期间记录小鼠体重。根据公式：肿瘤生长抑制(TGI)指数＝ΔT/ΔC，计算PDX肿瘤组织TGI指数并评价药物敏感性，通过lncRNA测序筛选肝内胆管癌(ICC)索拉菲尼敏感与耐药的差异lncRNA。在人ICC细胞系HuCCT1中转染小干扰RNA(siRNA)降低lncRNA SCDAL的表达，根据siRNA序列分组为ctr、si-1、si-2和si-3。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖能力，根据给药浓度分组为0 μmol/L(0.1%二甲基亚砜)、4 μmol/L、10 μmol/L。组间比较采用 t检验，多组间两两比较采用单因素方差分析，Turkey事后检验确定组间差异。 结果:肝细胞肝癌(HCC)及ICC PDX模型鼠索拉非尼给药组与对照组体重差异无统计学意义[HCC：(24.72±2.21) g比(25.80±2.30) g， t＝0.486， P>0.05；ICC：(24.87±4.30) g比(23.11±2.78) g， t＝0.478， P>0.05]；lncRNA SCDAL在PDX耐药样本中表达显著低于敏感组(|log2FoldChange|＝Inf， P<0.05)；Si-3敲减组lncRNA SCDAL相对表达量显著低于对照组(0.586±0.080比1.000±0.234， P<0.05)。索拉菲尼给药条件下敲减组细胞吸光度值显著高于对照组(4 μmol/L：1.11±0.06比0.86±0.07， t＝4.635， P<0.01；10 μmol/L：0.52±0.03比0.42±0.02， t＝4.389， P<0.05)。 结论:通过构建肝癌患者PDX模型并测序验证发现lncRNA SCDAL表达与ICC索拉菲尼敏感性呈正相关。

目的:探讨基于生物信息学方法构建的肾透明细胞癌（ccRCC）预后相关的铜死亡相关差异长链非编码RNA（lncRNA）评分公式在患者临床诊断、预后预测以及治疗抉择中的价值。方法:从癌症基因组图谱（TCGA）数据库获取ccRCC患者的基因矩阵和临床数据（数据更新至2022年3月29日）。基因矩阵收录539例ccRCC组织和72例癌旁正常组织表达数据；临床数据收录530例ccRCC患者资料。采用Pearson相关性分析、Wilcoxon符合秩检验和单因素Cox比例风险模型分析筛选预后相关的铜死亡相关差异lncRNA。采用R软件将530例包含生存资料的ccRCC患者以近似1∶1的比例随机抽样分组，分为训练集（266例）和验证集（264例）。采用LASSO回归构建铜死亡相关差异lncRNA评分公式并进行交叉验证。采用受试者工作特征（ROC）曲线评估铜死亡相关差异lncRNA评分公式的特异度和灵敏度，计算曲线下面积（AUC）。根据中位风险值将ccRCC患者分为低风险组和高风险组，采用Kaplan-Meier法分析高、低风险组患者总生存（OS）的差异。采用 t检验分析不同临床病理特征患者的风险值差异。采用R包rms构建可以预测ccRCC患者1、3、5年OS率的列线图。采用R包pRRophetic预测ccRCC患者临床治疗中常见的靶向药物（如索拉菲尼、舒尼替尼等）的半数抑制浓度（ IC50），采用Wilcoxon符号秩检验比较高、低风险组患者 IC50值。收集山西医科大学第一医院2021年6月至12月行根治性肾切除术患者经病理检测确诊的20例ccRCC组织及其配对癌旁正常组织。实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测ccRCC组织关键lncRNA的表达。 结果:基于TCGA数据库中ccRCC患者10个铜死亡基因（FDX1、LIAS、LIPT1、DLD、DLAT、PDHA1、PDHB、MTF1、GLS、CDKN2A）的表达矩阵，筛选出153个与预后相关的铜死亡相关差异lncRNA。LASSO回归分析，最终得到包含4个铜死亡相关差异lncRNA的评分公式：风险值=0.020×AC015912.3+0.011×AC026401.3+0.063×AC103706.1+（-0.076）×EPB41L4A-DT。根据中位风险值（0.76）将患者分为高风险组（≥0.76）和低风险组（<0.76）。ROC曲线结果显示，评分公式对于患者1、3、5年OS率的预测准确性较好。训练集、验证集、总队列中高风险组均较低风险组患者OS更差（均 P<0.001）。年龄、病理分级、肿瘤分期、根据铜死亡相关差异lncRNA评分公式计算的风险值是OS的独立影响因素（均 P<0.001）。铜死亡相关差异lncRNA评分公式计算得到的风险值在不同病理分级、肿瘤分期、T分期、N分期、M分期患者间差异均有统计学意义（均 P<0.01），但在不同性别、年龄患者间差异均无统计学意义（均 P>0.05）。构建的列线图对于患者1、3、5年OS率具有较好的预后准确性。高风险组应用舒尼替尼、西罗莫司敏感性更高，低风险组应用阿昔替尼、索拉非尼、帕唑帕尼敏感性更高。qRT-PCR检测结果表明，ccRCC肿瘤组织与癌旁组织比较，AC015912.3基因相对表达量为1.00±0.04比0.68±0.24（ t=6.37， P<0.01），AC026401.3基因相对表达量为1.00±0.05比0.64±0.22（ t=7.29， P<0.01），AC103706.1基因相对表达值为1.00±0.04比0.64±0.20（ t=7.49， P<0.01），EPB41L4A-DT基因相对表达量为1.00±0.06、0.73±0.10（ t=10.68， P<0.01）。 结论:基于TCGA数据库构建的铜死亡相关差异lncRNA评分公式可作为ccRCC患者临床诊断、预后预测的新型指标，帮助指导患者的临床药物治疗，有助于精准诊疗。

目的 探索多靶点激酶抑制剂索拉非尼对心肌细胞损伤的关键基因,为临床防治索拉非尼对心肌细胞损伤提供新靶点.方法 GEO数据库中下载数据集GSE88944,该数据集总例数为10例,其中正常组5例,索拉非尼组5例;采用GEO2R在线工具进行数据分析,以logFC(fold change)绝对值>2且Padj<0.05为标准筛选差异基因.对差异表达编码基因分别进行GO富集及KEGG通路分析,构建蛋白-蛋白互作网络,筛选关键基因,构建关键基因及编码蛋白-蛋白互作网络.结果 共筛选出差异基因238个,其中蛋白编码差异基因(Pc-DEGs)208个,非编码差异基因30个,Pc-DEGs中上调基因56个、下调基因152个;Pc-DEGs主要参与的生物学过程包括血管生成、心肌收缩、血压的调节、血管生成的正向调节;细胞组分细胞外区域、质膜的整体组成部分、Z盘;分子功能主要有受体结合、肝素结合、整合素结合、钙离子结合等.KEGG结果显示,Pc-DEGs主要富集在肥厚型心肌病、MAPK信号传导途径、扩张型心肌病、cAMP信号传导途径、心肌收缩等信号通路;共筛选出CTGF(CCN2)、FOS、JUN、POSTN、EDN1、SERPINE1、IGF1等7个关键下调基因.结论 CTGF(CCN2)、FOS、JUN、POSTN、EDN1、SERPINE1、IGF1是首个口服多靶点酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼致心肌毒性的关键下调基因,这可能为多靶点酪氨酸激酶抑制剂索拉菲尼心肌毒性提供新的治疗靶点.

目的 探究索拉菲尼(sorafenib)通过细胞凋亡和自噬对人宫颈癌细胞系HeLa增殖的影响,及对HeLa细胞耐药性的影响.方法 用间歇诱导法构建耐药细胞株,以 0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0 μmol/L为梯度的索拉菲尼处理HeLa细胞,每个浓度维持 1 周,并筛选出可稳定传代的耐药细胞株;MTT法检测索拉菲尼对细胞增殖的影响;流式细胞术分析细胞周期分布情况;RT-qPCR检测亲本株和耐药株在不同药物浓度下耐药和凋亡基因表达水平的变化.Western blot检测与自噬相关的标志物蛋白LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的变化.结果 成功获得稳定的耐药株;经药物处理的细胞更多的被阻滞在G1 期.在耐药细胞中,凋亡抑制基因Bcl-2 表达量显著降低;凋亡基因Bax表达量明显增加;耐药基因表达明显升高.Western blot中耐药细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著高于亲本细胞(P＜0.05).结论 索拉菲尼通过阻滞细胞周期抑制HeLa细胞增殖并诱导其自噬.细胞自噬在宫颈癌治疗过程中可能参与了细胞耐药的发展,促进细胞存活;在一定程度下,药物诱导的细胞自噬能激活耐药细胞的凋亡信号通路,促进细胞耐药逆转.

以Ras 同源基因家族成员C(Ras homolog gene family member C,RhoC)为靶点探讨栓菌酸(trametenolic acid,TA)对人肝癌HepG2.2.15 细胞迁移侵袭的影响及机制,为栓菌酸的利用提供依据.采用MTT法检测TA对HepG2.2.15 细胞增殖的影响;划痕实验、Transwell实验检测TA对细胞迁移、侵袭的影响;pull down实验检测TA对Ras相似物GTP 酶(Ras homo-logue GTPases,Rho GTPases)活性的影响;Western blot实验检测TA对RhoC从胞质到胞膜转运及对RhoC/Rho相关激酶 1(Rho-associated kinase 1,ROCK1)/肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)/基质金属蛋白酶 2(matrix metalloprotease 2,MMP2)/基质金属蛋白酶 9(matrix metalloprotease 9,MMP9)通路相关蛋白表达的影响;采用瞬时质粒转染过表达pcDNA3.1-RhoC,激光共聚焦检测细胞骨架中F-actin的变化,并检测细胞迁移侵袭及RhoC/ROCK1/MLC/MMP2/MMP9 通路相关蛋白表达的变化,以及RhoC GTP酶活性;建立BALB/c 裸鼠皮下移植瘤模型,以索拉菲尼为阳性对照(Sora 20 mg·kg-1),测量TA低、中、高剂量组(40、80、120 mg·kg-1)瘤体积和质量,瘤组织通过Western blot检测相关蛋白的表达.结果显示,TA呈浓度依赖性抑制HepG2.2.15 细胞增殖,24、48 h的IC50 分别为 66.65、23.09 μmol·L-1.裸鼠肿瘤质量、肿瘤体积均显著降低,索拉菲尼,TA低、中、高剂量组的抑瘤率分别为 62.23%、26.48%、55.45%、62.36%.TA能显著降低HepG2.2.15 细胞迁移侵袭数,且呈浓度依赖性抑制RhoC蛋白的表达及RhoC GTP酶活性,使膜组分RhoC显著下调,减少膜结合RhoC GTP 酶的量.体内外实验证实,TA可显著抑制RhoC下游ROCK1、MLC、p-MLC、MMP2、MMP9 蛋白表达.HepG2.2.15 细胞转染pcDNA3.1-RhoC过表达RhoC后,TA能有效抑制过表达后RhoC、ROCK1、MLC、p-MLC、MMP2、MMP9 蛋白的表达水平,及RhoC GTP酶的活性,与过表达前相对抑制水平相似.综上所述,TA可抑制人肝癌HepG2.2.15 细胞迁移侵袭,其机制可能是通过靶向抑制RhoC GTP酶的活性,下调RhoC表达,从而抑制RhoC/ROCK1/MLC/MMP2/MMP9 信号通路.该研究为利用中药有效成分多靶点优势,开发以热休克蛋白 90α(heat shock protein 90α,HSP90α)为靶点的自噬调节剂,达到阻滞肝癌细胞增殖,同时抑制肝癌细胞的侵袭和转移双重作用提供了新思路和方法.

鉴于我国肝细胞癌的高发率和中晚期肝癌的高检出率,患者就诊时已失去手术切除癌组织的机会,而临床上对于不可手术切除的肝癌患者进行单一的治疗往往无法获得良好的预后效果,且5年生存率低.因此,急需规范的综合治疗手段提高晚期肝癌患者的总生存期.通过复习国内外开展的针对中晚期肝癌患者治疗的临床实验,发现阿替利珠单抗联合贝伐株单抗用于不可手术切除的晚期肝癌患者在总生存期、无病进展期和药物不良反应发生率方面明显优于单药纳武力尤单抗和派姆单抗,同时,瑞戈非尼靶向治疗索拉菲尼耐药的肝癌患者也取得了更长时间的中位生存期.由于单独应用免疫治疗或靶向治疗不能达到晚期肝癌患者无瘤生存的要求,因此介入手术治疗联合免疫治疗或靶向治疗可明显缩短患者总治疗时间,且药物不良反应分级更低,增加了患者的依从性.通过对现有临床药物试验结果的总结和分析,在提高肝癌患者药物获益率和降低不良反应等方面具有重要意义.

目的:探讨美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏对肝癌耐5-氟尿嘧啶细胞(BEL-7402/5-FU)自噬和转移侵袭能力的影响.方法:以肝癌敏感细胞BEL-7402和肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU作为实验对象,给予索拉菲尼、CⅡ-3和脱脂膏处理,检测自噬标志蛋白的生成,同时检测细胞中自噬相关因子和侵袭转移相关因子的水平以及细胞侵袭转移能力的变化.结果:耐药细胞组中p62蛋白低表达,给予阳性药索拉菲尼、CⅡ-3和脱脂膏后,细胞中p62蛋白表达量明显升高.和敏感细胞相比,耐药细胞中LC3B生成增多,给予CⅡ-3后LC3B生成减少.CⅡ-3和脱脂膏给药组均能明显抑制自噬和侵袭转移的部分相关因子的表达,包括降低ATG5、PIK3C3、BECLIN、LC3B、MMP-9、Akt、4EBP1 mRNA表达.划痕试验结果显示,相比于敏感细胞,耐药细胞具有更强的侵袭转移能力,给予索拉菲尼和CⅡ-3作用后均可显著抑制细胞的侵袭转移,而脱脂膏则无显著的抑制效果.结论:肝癌耐药细胞具有很强的自噬和侵袭转移能力,而美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏体外均能明显抑制耐药细胞的自噬和侵袭转移,但仅能影响部分相关因子.

目的:探索Sirtuin4(SIRT4)调控肿瘤谷氨酰胺代谢的机制,明确SIRT4对肝癌细胞干性及索拉菲尼治疗敏感性的影响.方法:通过实时定量PCR(real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)和免疫组织化学染色检测SIRT4在肝癌中的mRNA和蛋白表达水平.免疫印迹及细胞成球实验检测肿瘤细胞干性,细胞计数实验(CCK-8)和平板克隆实验检测肝癌细胞索拉菲尼治疗敏感性.免疫共沉淀检测SIRT4对蛋白的去乙酰化作用.结果:在肝癌的临床样本组织和细胞系中,SIRT4的表达显著低于癌旁组织和正常肝细胞.在体外实验中,过表达SIRT4能够明显降低肝癌细胞的成球数量(P＜0.01)和干性标志物表达,并使索拉菲尼治疗的肝癌细胞克隆数和OD450值进一步下降(均P＜0.01).机制研究表明,SIRT4通过去乙酰化降低谷氨酰胺合成酶2(glutamine synthase 2,GLS2)的表达,进而抑制肝癌细胞中谷氨酰胺的分解代谢,从而调节肝癌细胞的干性和对索拉菲尼的敏感性.结论:SIRT4在肝癌组织中表达显著降低,能够通过降低谷氨酰胺分解代谢,进而抑制肝癌细胞的干性并增强其对索拉菲尼的敏感性.

目的:探究天然化合物姜黄素与化疗药物索拉菲尼在体外的联合抗肾癌作用及其作用机制.方法:以肾癌细胞780-0为研究对象,采用MTT法测定细胞生长抑制率,采用荧光定量PCR(Real-time PCR)方法检测凋亡通路基因表达,采用4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色法观察细胞凋亡小体数量,采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测细胞凋亡通路及自噬通路相关蛋白表达.采用吖啶橙染色法检测细胞中自噬通量的水平.结果:与对照组相比,姜黄素及索菲拉尼呈浓度依赖性降低肾癌细胞780-0细胞活力.与索菲拉尼处理组相比,姜黄素联合索菲拉尼处理组中Bax、ATG5及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ表达显著升高,Bcl-2的表达量显著降低,表明姜黄素能加剧索菲拉尼诱导的肾癌细胞780-0中凋亡及自噬信号的表达.吖啶橙染色结果进一步表明姜黄素加剧索菲拉尼诱导的肾癌细胞780-0自噬流水平.与此同时,在使用自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤抑制细胞自噬后,由姜黄素和索菲拉尼联合诱导的肾癌细胞780-0凋亡现象被抑制.结论:姜黄素可以加剧索拉菲尼诱导的肾癌细胞780-0凋亡,并且其可能是通过激活细胞内自噬信号来实现的.