目的:分析在第二代嵌合抗原受体(CAR)的基础上设计的同时分泌白细胞介素7(IL7)和趋化因子19(CCL19)的第四代嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)，在多发性骨髓瘤微环境中增殖、趋化、清除肿瘤细胞和持久性等方面的能力。方法:通过2A自剪切肽技术构建第四代CAR载体质粒，采用第三代慢病毒包装系统制备高滴度慢病毒，通过流式细胞术检测慢病毒转导效率和CAR-T细胞亚型的变化；采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测CAR-T细胞中IL7和CCL19的分泌情况；手工计数法分析CAR-T细胞在培养过程中的增殖活性；Transwell迁移实验验证CAR-T细胞趋化能力；荧光素酶生物发光法检测CAR-T细胞特异性杀伤活性；小鼠异体移植模型验证CAR-T细胞体内抗骨髓瘤活性和安全性。结果:流式细胞术结果显示，抗CS1 CAR-T和抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T细胞CAR的表达率分别为(91.50±0.29)%和(46.70±0.12)%，表明CAR-T细胞构建成功。亚型分析显示，抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T细胞中T记忆干细胞(TSCM)的比例为(67.58±0.59)%，高于抗CS1 CAR-T[(50.74±1.01)%， P＝0.000 1]，具有更强的免疫记忆功能，持久性更佳。抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T细胞较对照组(MOCK-T)和抗CS1 CAR-T组能够持续分泌IL7和CCL19( P<0.000 1)。抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T细胞在慢病毒转导后的第9天细胞数达到(22.77±0.79)×10 6个，高于抗CS1 CAR-T细胞[(9.40±0.79)×10 6个， P＝0.000 1]，具有更强的增殖能力。Transwell迁移实验中，抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T细胞对于反应T细胞的趋化细胞数为(109.00±4.04)个/视野，高于对照组和抗CS1 CAR-T组[分别为(9.33±1.20)个/视野和(7.33±0.88)个/视野，均 P<0.000 1]，具有更强的趋化能力。杀伤实验结果显示，与对照组细胞比较，抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T和抗CS1 CAR-T均具有特异性的杀伤效能( P<0.000 1)。动物实验表明，抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T细胞降低了荷瘤小鼠的肿瘤负担( P<0.000 1)，并延长了总生存时间( P＝0.006 1)。 结论:第四代抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T细胞在不影响体内外抗骨髓瘤活性的情况下，有着更强的增殖活性、趋化能力和持久性，为克服传统CAR-T细胞存活率低下、持久性差以及受肿瘤微环境抑制等缺陷提供了策略，为第四代CAR-T细胞的临床应用提供了前期实验依据。

目的:构建一种靶向CD52的嵌合抗原受体T细胞（CD52 CAR-T），探索其对CD52 +白血病的治疗效果。 方法:应用分子克隆技术构建以CD52为抗原结合区的CD52 scFv、4-1BB为共刺激分子的二代CAR-T细胞。慢病毒载体包装后感染T细胞，制备CD52 CAR-T细胞，通过流式细胞术检测CD52 CAR-T细胞CD4、CD8细胞亚群及其分化状态。通过体外杀伤实验、脱颗粒实验及细胞因子的释放等功能实验，观察CD52 CAR-T细胞对CD52 +白血病细胞的特异性细胞毒作用。 结果:①成功构建了pCDH-CD52 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ-GFP表达载体，感染人T细胞，获得靶向CD52的CAR-T细胞。②感染CD52 CAR表达载体的第6天，T细胞中表达CD52的细胞可被清除[CD52 CAR-T组CD52 + T细胞为（4.48±4.99）%，Vector-T组为（56.58±19.8）%， P=0.011]。③CD52 CAR-T的自我杀伤不会影响T细胞的增殖，培养后期CD52 CAR-T组的增殖速度高于Vector-T组。④T细胞表型检测发现CD52 CAR可以促进CAR-T细胞向中心记忆T细胞及效应记忆T细胞分化，减少CAR-T细胞向终末效应细胞分化。⑤CD52 CAR-T细胞与HuT78-19t及MOLT4-19t靶细胞以效靶比1∶1共培养24 h，HuT78-19t细胞可被清除，而对MOLT4-19t细胞无明显杀伤作用[（2.66±1.60）%对（56.66%±5.74）%， P<0.001]。⑥脱颗粒实验显示，HuT78-19t细胞对CD52 CAR-T细胞的激活作用显著高于MOLT4-19t细胞[（57.34±11.25）%对（13.06±4.23）%， P<0.001]。⑦CD52 CAR-T与HuT78-19t细胞共培养48 h上清中细胞因子分泌水平[IFN-γ（3706±226）pg/ml、TNF-α（1732±560）pg/ml]远高于MOLT4-19t细胞组[IFN-γ（1577±846）pg/ml、TNF-α（74±12）pg/ml]（ P值均<0.01）。 结论:该研究成功制备了具有抗白血病作用的CD52 CAR-T细胞，为进一步的靶向CD52的免疫治疗奠定了基础。

目的:系统性研究表达白细胞介素7（IL7）和趋化因子C-C基序配体19（CCL19）的第四代靶向CD19嵌合抗原受体T细胞（CD19 CAR-T）联合PD-1单抗治疗复发难治大B细胞淋巴瘤的疗效及安全性。方法:应用自体7×19 CAR-T联合替雷利珠单抗治疗11例复发难治大B细胞淋巴瘤患者，评估其疗效及不良反应。结果:11例入组患者均完成自体7×19 CAR-T的制备和回输，9例患者完成预定的6次替雷利珠单抗治疗，1例患者完成4次，1例患者完成1次。5例（45.5%）达完全缓解，3例（27.3%）达部分缓解，客观缓解率72.7%。2例评估为疾病进展，1例在回输后2个月因疾病不能控制而死亡。中位随访时间31（2~34）个月，中位总生存时间未达到，中位无进展生存时间为28（1~34）个月，2例部分缓解患者分别在随访第9个月和第12个月进一步获得完全缓解，故最佳完全缓解率为63.6%。细胞因子释放综合征和免疫效应细胞相关神经毒性综合征均可控，未见免疫相关不良反应发生。结论:自体7×19 CAR-T联合替雷利珠单抗治疗复发难治大B细胞淋巴瘤取得较好疗效，且不良反应可控。

目的:分析复发/难治性急性B淋巴细胞白血病（R/R B-ALL）自体CD19嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）制备过程中，培养体系中残留白血病细胞导致CD19 CAR转入白血病细胞的特征和体外杀伤研究。方法:①收集30例接受CD19 CAR-T细胞治疗的R/R B-ALL患者及6例健康志愿者外周血单个核细胞（PBMC）；②流式细胞术分析R/R B-ALL患者PBMC经CD3磁珠分选后及体外培养过程中体系白血病细胞残留情况；③患者及健康志愿者PBMC CD3 + T细胞转染CD19 CAR及CD22 CAR慢病毒，制备CD19 CAR-T、CD22 CAR-T细胞；④复苏Nalm-6细胞株，CD19 CAR慢病毒转染Nalm-6细胞，制备CD19 CAR-Nalm-6细胞，同时转染患者原代ALL细胞；⑤流式细胞术检测转染率；⑥CCK-8法检测细胞增殖；⑦乳酸脱氢酶（LDH）法检测CD19 CAR-T、CD22 CAR-T细胞对Nalm-6细胞及CD19 CAR-Nalm-6细胞杀伤活性。 结果:①30例接受CD19 CAR-T细胞治疗的R/R B-ALL患者中，2例CD3 + T细胞中发现3.32%、2.04%的白血病细胞残留，随体外培养时间延长，在培养第4天，白血病细胞完全消失。②体外培养中CD19 CAR-Nalm-6细胞增殖率高于Nalm-6细胞。③效靶比为1∶1且共培养24、48、72 h，CD19 CAR-T细胞对Nalm-6细胞的杀伤活性高于CD19 CAR-Nalm-6细胞；与CD19 CAR-T细胞相比，CD22 CAR-T细胞对CD19 CAR-Nalm-6细胞的杀伤活性更高。④相同效靶比情况，单独应用CD22 CAR-T细胞对CD19 CAR-Nalm-6细胞的杀伤活性高于CD19 CAR-T联合CD22 CAR-T细胞。 结论:CD19 CAR-T细胞制备过程中培养体系残留白血病细胞可能会导致CD19 CAR被引入白血病细胞中而导致CD19 CAR-T细胞治疗失败，在细胞制备过程中需要检测培养体系中白血病细胞的残留情况。CD22 CAR-T细胞治疗可作为上述情况的挽救治疗措施之一。

本研究分析了共表达白细胞介素-15(interleukin-15,IL-15)和趋化因子配体19(C-C chemokine ligand 19,CCL19)的EGFRvⅢ CAR-T细胞的功能特性及其体外特异性杀伤效果,旨在优化CAR-T细胞多项功能,提高靶向 EGFRvⅢ 的 CAR-T细胞对胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)的治疗效果.通过基因工程技术获得重组慢病毒质粒,转染 293T 细胞获得慢病毒并感染 T 细胞获得靶向EGFRvⅢ的第四代CAR-T细胞(EGFRvⅢ-IL-15-CCL19 CAR-T).利用流式细胞仪、细胞计数仪、趋化小室、凋亡试剂盒等检测了第四代和第二代CAR-T细胞(EGFRvⅢ CAR-T)的CAR分子表达率、增殖、趋化能力、体外特异性杀伤能力及抗凋亡能力等.结果表明,与EGFRvⅢ CAR-T细胞相比,EGFRvⅢ-IL-15-CCL19 CAR-T细胞能成功分泌IL-15 和CCL19,具有更强的体外增殖能力、趋化能力以及抗凋亡能力(P值均<0.05),而体外特异性杀伤能力无显著差异.因此,靶向 EGFRvⅢ且同时分泌IL-15 和CCL19 的CAR-T细胞有望提高胶质母细胞瘤的治疗效果,为临床试验提供一定的参考依据.

目的 评价嵌合抗原受体(CAR)T细胞技术治疗复发、难治儿童急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)的疗效,探讨影响预后的因素.方法 2014年9月至2017年8月应用第四代CD19特异性CAR-T细胞治疗复发、难治CD19阳性B-ALL/B淋巴母细胞性淋巴瘤患儿48例,其中男29例,女19例,中位年龄8(3～ 17)岁.48例患儿共接受61次CAR-T细胞输注,观察输注后的不良反应,治疗前后应用流式细胞术或实时定量聚合酶链反应方法监测白血病微小残留病(MRD)水平.中位随访时间406(16～1 259)d.结果 61例次CAR-T细胞输注过程中均无不良反应.CAR-T细胞输注后最常见的不良反应为细胞因子释放综合征(CRS).仅2例患儿出现3级CRS表现,包括持续高热、惊厥、谵妄、浆膜腔积液、血压下降等,1例经对症治疗后好转,另1例应用妥珠单抗治疗后缓解.无一例患者发生CAR-T细胞治疗相关死亡.CAR-T细胞治疗反应率为77.1％,反应出现的时间为输注后第7～ 28天,CAR-T细胞输注前肿瘤负荷＜5％组与≥5％组的反应率分别为87.1％和58.8％(x2=4.968,P=0.036).对于有治疗反应的37例患儿,2年总生存率和年龄、疾病状态及CAR-T细胞输注前的肿瘤负荷相关(P＜ 0.05);而CAR-T细胞输注前的肿瘤负荷≥5％ [RR=3.433 (95％ CI 1.333～8.844),P=0.011]及未桥接造血干细胞移植(HSCT) [RR=4.996(95％CI 1.852～ 13.474),P=O.001]是影响患儿无事件生存的独立危险因素.结论 抗CD19的CAR-T细胞技术治疗儿童复发、难治B-ALL安全有效.通过有效的预处理手段,尽可能降低CAR-T细胞输注前的肿瘤负荷有利于提高CAR-T细胞治疗的反应率.对于难治性白血病或仅分子水平复发的患儿进行CAR-T细胞治疗后桥接HSCT可能是更优的治疗策略.

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T疗法)是一种治疗肿瘤的新免疫疗法,通过向患者自身T细胞中导入已被修饰的CAR基因,使T细胞表达结合肿瘤表面抗原的特异性受体来实现对肿瘤的精准治疗.目前已发展到第四代.该免疫疗法在血液瘤和实体瘤治疗中都有一定疗效,同时也存在一些待解决难题.本文就近年来CAR-T在血液瘤和实体瘤中的研究治疗进展及存在的问题进行综述.

基于嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)的过继免疫疗法已被证明是治疗恶性肿瘤最有希望的策略之一,但是目前其在实体瘤中的应用依然有限.研究表明磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)对肝细胞癌来说是一种有意义的诊断、治疗和预后生物标志物,且已有利用第二代/第三代GPC3靶向的CAR-T细胞治疗肝细胞癌的研究报道.为了进一步提高治疗效果,构建同时表达GPC3 CAR、人源IL-7和CCL19细胞因子的第四代慢病毒载体,转染293T细胞包装慢病毒并感染人T淋巴细胞制备靶向GPC3的第四代CAR-T细胞(GPC3-BBZ-7×19).利用细胞计数、趋化小室、荧光素酶生物发光法以及流式细胞术等比较其与第二代GPC3 CAR-T细胞(GPC3-BBZ)在增殖、迁移、杀伤以及亚型分布方面的区别,评估GPC3-BBZ-7×19 CAR-T细胞对免疫缺陷小鼠体内GPC3阳性的肝细胞癌腹腔移植瘤生长的作用.结果 表明与GPC3-BBZ CAR-T细胞相比,GPC3-BBZ-7× 19 CAR-T细胞具备更强的增殖能力、趋化能力以及记忆干细胞(Stem memory T cell,Tscm)组成比(P值均＜0.05),而在体外特异性杀伤GPC3阳性的肝细胞癌细胞以及细胞因子分泌水平方面无显著差异.此外,GPC3-BBZ-7×19 CAR-T细胞能够明显抑制免疫缺陷小鼠体内的GPC3阳性肝细胞癌移植瘤模型.因此靶向GPC3的第四代CAR-T细胞(分泌IL-7和CCL19)有望比第二代GPC3靶向的CAR-T细胞更持久有效地对抗肿瘤,并产生针对肿瘤的记忆功能,为以后的临床试验提供了临床前研究基础.

该研究构建了靶向CD138的第四代CAR-T细胞(分泌IL-7和CCL19),通过与靶向CD138的第二代CAR-T细胞进行生物学功能比较,探讨第四代CAR-T细胞应用于临床的优势.使用慢病毒转染健康人外周血的T细胞制备出靶向CD138的第二代和第四代CAR-T细胞,CFSE标记法检测T细胞的增殖能力,Transwell实验检测T细胞的趋化能力,ELISA检测细胞因子分泌水平,流式细胞术检测T细胞的CAR表达率和亚型.荧光素酶生物发光法检测CAR-T细胞对多发性骨髓瘤细胞株的体外杀伤功能;构建人多发性骨髓瘤NCG小鼠模型,通过生物发光成像系统监测CAR-T细胞输注后小鼠肿瘤的消退情况.结果 显示,靶向CD138的第四代CAR-T细胞(CD138-BBZ-7× 19)在体外的生物学功能优于第二代CAR-T细胞(CD138-BBZ),而且在人多发性骨髓瘤动物模型中具有明显的抗肿瘤作用.

在第一部分的综述中,概述了PET/CT在嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗淋巴瘤中的作用;着重介绍了治疗后 1 个月(M1)PET/CT对疾病治疗响应的预测价值,并提示把M1 作为治疗响应评估的首选时间段,用于制定治疗干预计划的参考标准.除了治疗中期的影像结果外,患者基线期的代谢参数也是治疗响应重要的预测因素;另外,所有癌症治疗方式都存在不良反应,CAR-T细胞治疗也不例外.在CAR-T细胞输注中,主要的毒性表现为靶向效应,其主要与靶抗原和T细胞活性相关,在大多情况下可以通过对靶细胞或CAR-T细胞的调节来解除.研究证明,基线期PET/CT可预测不良反应的发生,本文将重点介绍代谢参数的预后价值以及风险评估.