[目的]建立一种高效、简便制备双脱氧核苷(ddATP、ddTTP、ddGTP和ddCTP)封闭寡聚核苷酸的方法.[方法]选取乙醛脱氢酶(ALDH)基因,设计特异性上、下游引物.使用末端转移酶和碱性磷酸酶对引物进行双脱氧核苷修饰,利用荧光定量PCR对制备的封闭引物进行验证,并结合校读PCR对突变体进行检测.[结果]经过ddNTP封闭的引物,在普通荧光PCR体系中无法进行引物延伸;在校读PCR体系中则可以区分ALDH2的两种等位基因.[结论]该方法可以高效合成4种双脱氧核苷封闭的寡聚核苷酸,并且这种封闭的引物可以结合校读PCR对单核苷多态性进行检测.

目的 基于液相芯片技术,建立一种可同时、快速检测细胞色素P4502C9(cytochrome P4502C9,CYP2C9)、CYP2C19、CYP4F2、维生素K环氧化物还原酶(vitamin K epoxide reductase,VKORC1)及ATP结合盒亚家族B成员1(ATP-binding cassette subfamily B member1,ABCB1)等与华法林和氯吡格雷相关药物基因多态性的方法.方法 方法学的建立.从Genbank中查找与华法林和氯吡格雷药物相关的8个靶位点附近基因序列,设计特异性引物和探针;通过多重PCR扩增,等位基因特异性引物延伸(allele specific primer extension,ASPE),MagPlex-Tag微球杂交,经液相芯片系统Luminex 200检测荧光信号,确定基因型;优化反应体系并进行方法学评价.收集2017年6月至2018年12月东莞市厚街医院抗血栓治疗患者血液样本,共260例,采用建立的方法检测其8个靶位点,并与测序结果比较.结果 本方法检测260例样本结果显示:纯合子荧光强度中位值(median fluorescence intensity,MFI)比率均>0.9或<0.1,杂合子MFI比率均在0.3～0.6之间;各基因型批内和批间变异系数分别低于6.4％和10.9％;所需DNA最低检测限为0.75 ng;260例样本的检测结果与测序结果完全一致.结论 本研究采用液相芯片技术,成功建立了快速检测华法林和氯吡格雷相关药物基因型的方法.

目的 建立一种可同时、快速检测2型糖尿病患者降糖药相关药物基因多态性的液相芯片检测系统.方法 根据7个目的基因的rs号,在Genbank中查找其靶位点附近碱基序列(目的基因包括磺脲类受体1,转录因子7类似物2,胰岛素受体底物1,过氧化物酶体增殖物激活受体γ,有机阳离子转运蛋白与多药和有毒化合物排出家族,有机阴离子转运蛋白家族成员1B1等),以PrimerPlex软件设计等位基因特异性引物,Primer6.0软件设计含检测位点的PCR引物,通过多重PCR扩增,等位基因特异性引物延伸(ASPE),MagPlex～Tag微球杂交,液相芯片系统Luminex 200检测荧光信号,确定基因型,优化反应体系并以5份代表性标本进行方法学评价.收集2019年1月～12月东莞市厚街医院新诊2型糖尿病患者血液样本115例,采用建立的系统检测上述7个靶位点,并随机选取25例与测序结果比较.结果 7个目标基因经PCR扩增,产物电泳成像后清楚可见7条目标条带,无非特异性条带;经优化ASPE杂交条件,选择退火温度55℃,Biotion～dCTP浓度与dCTP浓度的比值为3:1,37℃孵育45 min时检测效果最佳;临床样本检测结果显示:纯合子荧光强度中位值(median fluorescence intensity,MFI)比率均>0.9或<0.1,杂合子MFI比率在0.4～0.6之间.纯合子MFI比率批内批间CV在0.9％～3.3％和2.1％～4.6％,而杂合子则在2.9％～7.3％和5.2％～11.2％;DNA最低检测限为0.75ng;25例样本的检测结果与测序结果完全一致,准确度100％.结论 该研究成功建立了一种新的液相芯片检测系统,高效便捷,能同时检测7个目的基因型,满足临床的需求.

1 案 例1.1 简要案情根据知情同意原则,使用PowerPlex? 21系统(美国Promega公司)对11942例中国山东汉族无关男性个体血斑样本进行DNA分型时,发现5例男性个体的STR分型图上只存在Y染色体Amelogenin扩增产物,而无X染色体Amelogenin特异性扩增产物,出现Amelo?genin基因座等位基因X缺失.对这5例男性样本分别应用3种试剂盒进行检测和Sanger测序.测序结果显示,5例样本均在Amelogenin基因序列的第304位发生突变,即A→G转换,这一转换可能导致引物和DNA模板无法结合和延伸,从而造成Amelogenin基因座X等位基因缺失.