目的:探讨单精子测序技术在植入前遗传学检测中的应用价值。方法:针对1例 FGFR3基因新发变异导致的软骨发育不良患者，应用单精子分离结合单精子测序技术完成单倍型的构建。用机械制动法分离20份单精子样本并进行全基因组扩增。设计变异位点及其上下游25个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点的扩增引物，对扩增产物进行检测，确定未携带以及携带致病变异的染色体单倍型。将12份胚胎滋养层细胞活检样本作为对象，在完成全基因组扩增后，通过高通量测序进行检测，判断胚胎携带致病变异的情况。选取可用囊胚进行移植。于孕19周抽取羊水样本，确认胎儿是否携带致病变异。 结果:通过单精子测序共筛选出8个SNP位点，成功构建单倍型。植入前单倍型分析提示5枚胚胎携带致病变异，7枚未携带。妊娠中期羊水基因检测证实胎儿未携带 FGFR3基因c.1138G>A变异。 结论:对于携带新发致病变异的男性患者，可通过单精子测序筛选SNP位点，通过连锁分析构建单倍型，进行胚胎植入前遗传学检测。

目的:评估单核苷酸多态性微阵列（single nucleotide polymorphisms array，SNP-array）技术和第二代高通量测序（next generation sequencing，NGS）技术在胚胎植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing，PGT）中的检测能力和效率。方法:回顾性描述分析2020年1月至2022年8月期间于广西壮族自治区妇幼保健院生殖中心就诊、夫妇双方均携带有明确致病性基因突变并要求进行第三代试管婴儿助孕的188例患者资料。经卵胞质内单精子注射授精和体外培养后，共收获995枚囊胚并进行活检。患者胚胎细胞遗传物质经全基因组扩增之后，分别采用SNP-array或NGS分析其携带致病基因突变和染色体拷贝数变异（copy number variation，CNV）的情况，同时采用Sanger测序或间隙聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）对突变进行直接检测。分析女方年龄和获囊胚数的关系、胚胎携带突变和致病性CNVs的比例，比较不同分子诊断技术在PGT中的检测成功率和准确性。经遗传学检测后，选择合适的胚胎进行子宫腔内移植，并于中孕期进行羊水穿刺产前诊断。结果:①成功对924个胚胎进行遗传学检测，总的检测成功率为92.9%。根据遗传学检测结果，共有389个（42.1%）胚胎可用于移植。②对胚胎进行缺失型α-地中海贫血突变检测，间隙PCR的成功率［84.9%（465/548）］低于SNP-array［98.7%（81/82）］和NGS［92.5%（431/466）］。对点突变进行检测，Sanger测序的成功率［98.5%（440/447）］与SNP-array［95.6%（110/115）］和NGS［96.1%（319/332）］的差异无统计学意义。有38个胚胎因等位基因脱扣导致直接位点检测法的结果与SNP单体型分析的结果不一致。另外，有4个胚胎因染色体重组导致SNP单体型分析失败。③与NGS相比，SNP-array检测CNV的成功率［83.7%（165/197）］较低，但是可检出更多种类的染色体拷贝数异常。④共进行了152例胚胎移植，其中有107例成功临床妊娠，有69例完成了羊水穿刺产前诊断，有42个健康儿顺利分娩。结论:从检测效率考虑，SNP-array适用于分析胚胎携带多个基因突变、罕见单基因突变或者缺失型突变，而NGS适用于检测常见的单基因突变类型。同时辅以Sanger测序和间隙PCR等技术对突变位点直接进行检测，可进一步提高PGT的检测成功率和准确性。本研究成果可为PGT从业者根据突变类型和患者的需求选择合适的检测平台提供依据。

目的:探讨极体测序技术在Van der Woude综合征患者胚胎植入前单基因遗传病检测中的应用价值。方法:对1例因 IRF6基因新发变异导致的Van der Woude综合征女性患者，应用极体测序技术进行胚胎植入前遗传学检测。6枚卵经卵胞质内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）受精后，分别顺序活检第一极体、第二极体和囊胚滋养外胚层细胞。活检细胞经全基因组扩增后，利用PCR联合Sanger测序的方法检测极体和胚胎的致病变异携带状态，推断对应胚胎的致病性。为预防因囊胚培养失败造成无可移植胚胎的情况，在囊胚形成前对1枚致病性低的优质胚胎进行玻璃化冷冻。此外，通过在夫妇双方以及特定基因型的极体和胚胎样本中对变异位点及其上下游1M区域内的175个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点进行靶向捕获高通量测序，连锁分析构建单体型。选择致病性低的胚胎移植，成功妊娠后进行产前诊断以及跟踪随访。 结果:成功获得第一极体和第二极体各6枚，其中11枚极体的变异位点检测成功。6枚胚胎中，1枚预测致病性低的胚胎在患者知情同意后于第4日（day 4，D4）玻璃化冷冻；1枚胚胎成功发育至囊胚，但致病性高；4枚胚胎囊胚培养失败。连锁分析成功构建出与致病变异紧密连锁的SNP单体型，胚胎单体型分析与Sanger测序结果吻合。移植致病性低的D4期冷冻胚胎，成功妊娠后，患者夫妇拒绝有创产前诊断。出生后新生儿随访未发现唇腭裂，脐血基因检测不携带致病变异。结论:本研究利用卵母细胞极体测序的检测方法，为1例因 IRF6基因新发变异导致的Van der Woude综合征女性患者进行胚胎植入前单基因遗传病检测，成功阻断了该病向子代传递。

目的:探讨单精子测序技术在脊髓性肌肉萎缩症(SMA)家系胚胎植入前单基因遗传病检测(PGT-M)中的应用价值。方法:选取2020年6月于江西省妇幼保健院就诊的一个生育过2例SMA患儿(均已夭折)的家系作为研究对象，利用机械制动法分离11份单精子样本并进行全基因组扩增，采用荧光定量PCR与Sanger测序法对扩增产物进行 SMN1基因变异检测。选取女方、女方父母和男方的基因组DNA，以及1份携带和2份未携带 SMN1基因变异的单精子扩增产物，在变异位点上下游2 Mb区域内选取100个单核苷酸多态性位点，设计引物进行靶向捕获高通量测序，通过连锁分析确定男女双方与 SMN1基因致病变异连锁的染色体单体型。经卵胞浆内单精子显微注射技术受精获取囊胚，活检滋养外胚层细胞，经全基因组扩增后行高通量测序检测胚胎的单体型，判断胚胎的致病性。对野生型胚胎进行染色体非整倍体检测，选择 SMN1基因型为正常的整倍体胚胎进行移植。于孕18周行羊水穿刺产前诊断，确认胎儿的基因型。新生儿出生后进行跟踪随访。 结果:基因检测发现夫妇双方均携带 SMN1基因第7、8外显子缺失杂合变异，其中女方携带的变异遗传自其父亲，男方为新发变异。利用单精子测序技术成功构建出男方单体型。PGT检测发现5枚胚胎携带 SMN1基因杂合变异，4枚为野生型，其中3枚为整倍体。移植1枚野生型整倍体胚胎，妊娠中期羊水检测证实胎儿未携带 SMN1基因第7、8外显子缺失变异。新生儿足月出生，随访9个月未见异常。 结论:应用单精子测序技术为1对夫妻双方均携带 SMN1基因第7、8外显子杂合缺失变异且男方为新发变异的夫妇构建出男方致病变异的连锁单体型，并为该夫妇提供PGT检测，成功避免了SMA患儿的出生。

植入前遗传学诊断(PGD)相关的技术在近20年迅猛发展,随之而来的是在技术应用时可能存在的问题和风险.从遗传咨询到胚胎培养、活检,再到遗传学诊断的各个环节都有需要引起重视的问题.等位基因脱扣和早期胚胎的染色体嵌合现象是目前诊断中最主要的导致误诊的风险因素.文章就目前PGD中各个可能的风险环节以及相应的应对措施进行阐述.

单细胞全基因组扩增(whole genome amplification,WGA)是指在单细胞水平对全基因组进行扩增的新技术,其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增,获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序,用于揭示细胞异质性.目前,WGA方法主要包括引物延伸预扩增(primer extension preamplification PCR,PEP-PCR)、简并寡核苷酸引物PCR(degenerate oligonucleotide primed PCR,DOP-PCR)、多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)、多次退火环状循环扩增(multiple annealing and looping-based amplifica-tion cycles,MALBAC)等.本文对不同的单细胞WGA方法的原理及应用情况分别进行了阐述,并对其扩增效率进行评价和比较,包括基因组覆盖度、均一性、重现性、SNV(single-nucleotide variants)和CNV(copy number variants)检测力等.综合对比不同单细胞WGA方法后发现,MALBAC的扩增均一性最高、等位基因脱扣率最低、重现性最好,且对于CNV和SNV的检测效果最好.本文还阐述了MALBAC技术在人类单精子减数重组、非整倍体分析以及人类卵细胞基因组研究中的应用.

目的 建立人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)基因配型,为开展HLA配型的胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)联合或不联合单基因病的临床工作提供技术支持.方法 采用多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)的方法扩增3～5个滋养层细胞的全基因组,并用多重聚合酶链式反应(PCR)方法扩增多个短串联重复多态性(polymorphic short tandem repeat,STR)位点,通过毛细管电泳技术验证STR位点的特异性.结果 微量细胞全基因组的扩增成功率为93.75％,筛选了HLA基因的5个杂合度高、特异性强的STR位点,等位基因脱扣(allele drop-out,ADO)率为10.34％.结论 微量细胞MDA结合多重PCR的方法可以同时检测HLA-A、HLA-B、DRA、DQB位点,扩增成功率高,ADO率低,可以有效地筛选出相匹配的胚胎,为同胞患儿提供造血干细胞来源具有可行性.

目的 建立一种基于囊胚细胞全基因组扩增(WGA)结合目的序列短片段Gap-PCR基因分型技术的α-地中海贫血东南亚型(SEA)缺失突变快速植入前遗传学诊断新方法.方法 以多重置换扩增(MDA)WGA技术为基础,建立以管家基因GAPDH和β-actin为目的序列的WGA产物双重荧光PCR质检体系,以及突变和正常序列短片段Gap-PCR的α-地中海贫血SEA缺失基因分型体系,通过对不同细胞数SEA携带者淋巴细胞样本的检测进行灵敏度与准确性评价,对12例囊胚活检样本的检测进行应用评价.结果 应用本研究建立的方法,不同淋巴细胞数样本的结果显示3细胞时即未出现等位基因脱扣,4细胞时目标模板的WGA产物量趋于稳定;10例WGA成功的囊胚活检样本的基因分型结果分别为--SEA/αα(5例)和αα/αα(5例),与验证基因型相符.结论 本研究建立的方法为一个完整检测流程,即以4～6个囊胚活检细胞为检材,对MDA产物进行WGA质检及相对浓度评估后,以短片段Gap-PCR体系而实现α-地贫SEA缺失的PGD快速基因分型;此方法简单快速、结果准确、检测成本低而适合临床常规应用.

植入前遗传学检测(PGT)应用于单基因病、染色体病、高龄和反复流产的患者,阻断了遗传缺陷向子代传递,提高了临床妊娠率.近年来,微阵列芯片和二代测序等PGT技术不断发展,提高了检测准确性,降低了误诊率,但仍然存在检测时间长、成本高、等位基因脱扣和无法识别染色体平衡易位等问题.针对以上问题,近来有新的技术方法应用于临床,能准确识别携带致病基因的染色体,鉴别易位携带状态的胚胎,提高异常胚胎的检出率,改善子代的临床结局.本文从PGT技术的发展进程、PGT技术在单基因病阻断和染色体平衡易位胚胎识别中的应用等方面进行综述.