目的:应用基于多次退火环状循环扩增(multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC)的单细胞测序技术分析卵裂期优质胚胎的嵌合体率及类型。方法:收集接受卵胞浆内单精子显微注射治疗并生育正常后代的夫妇捐献的卵裂期冷冻优质胚胎，解冻，消化透明带，收集卵裂球，进行单细胞全基因组扩增及二代测序。结果:共解冻胚胎23枚，收集184个卵裂球。175个(95.1%)卵裂球获得了测序结果，其中100个(57.1%)为非整倍体。在23枚胚胎中，3个(13.0%)为正常的二倍体，20个(87.0%)为嵌合体，其中包括5个(21.7%)非整倍体嵌合型、7个(30.4%)为二倍体-非整倍体嵌合型、5个(21.7%)为异常嵌合型、3个(13.0%)为无规律分离型。结论:卵裂期优质胚胎中存在较高的染色体嵌合体率。复杂染色体异常或高比例异常细胞的嵌合体可能是影响胚胎发育潜能的重要因素。

Background and objective Low-density computed tomography(LDCT)improved early lung cancer diagnosis but introduces an excess of false-positive pulmonary nodules data.Hence,accurate diagnosis of early-stage lung cancer remains challenging.The purpose of the study was to assess the feasibility of using circulating tumour cells(CTCs)to differentiate malignant from benign pulmonary nodules.Materials and methods 122 patients with suspected malignant pulmonary nodules detected on chest CT in preparation for surgery were prospectively recruited.Peripheral blood samples were collected before surgery,and CTCs were identified upon isolation by size of epithelial tumour cells and morphological analysis.Laser capture microdissection,MALBAC amplification,and whole-exome sequencing were performed on 8 samples.The diagnostic efficacy of CTCs counting,and the genomic variation profile of benign and malignant CTCs samples were analysed.Results Using 2.5 cells/5 mL as the cut-off value,the area under the receiver operating characteristic curve was of 0.651(95％confidence interval:0.538-0.764),with a sensitivity and specificity of 0.526 and 0.800,respectively,and positive and negative predictive values of 91.1％and 30.3％,respectively.Distinct sequence variations differences in DNA damage repair-related and driver genes were observed in benign and malignant samples.TP53 mutations were identified in CTCs of four malignant cases;in particular,g.7578115T＞C,g.7578645C＞T,and g.7579472G＞C were exclusively detected in all four malignant samples.Conclusion CTCs play an ancillary role in the diagnosis of pulmonary nodules.TP53 mutations in CTCs might be used to identify benign and malignant pulmonary nodules.

单细胞全基因组扩增(whole genome amplification,WGA)是指在单细胞水平对全基因组进行扩增的新技术,其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增,获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序,用于揭示细胞异质性.目前,WGA方法主要包括引物延伸预扩增(primer extension preamplification PCR,PEP-PCR)、简并寡核苷酸引物PCR(degenerate oligonucleotide primed PCR,DOP-PCR)、多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)、多次退火环状循环扩增(multiple annealing and looping-based amplifica-tion cycles,MALBAC)等.本文对不同的单细胞WGA方法的原理及应用情况分别进行了阐述,并对其扩增效率进行评价和比较,包括基因组覆盖度、均一性、重现性、SNV(single-nucleotide variants)和CNV(copy number variants)检测力等.综合对比不同单细胞WGA方法后发现,MALBAC的扩增均一性最高、等位基因脱扣率最低、重现性最好,且对于CNV和SNV的检测效果最好.本文还阐述了MALBAC技术在人类单精子减数重组、非整倍体分析以及人类卵细胞基因组研究中的应用.

目的:应用单细胞测序分析卵裂期优质胚胎染色体情况.方法:收集已成功生育健康婴儿的卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)周期中的优质卵裂期胚胎,消化胚胎透明带,收集卵裂球,并分别装管,进行多次退火环状循环扩增(MALBAC)单细胞全基因组扩增及二代测序.结果:收集优质卵裂期胚胎19枚,获得95个卵裂球,92个卵裂球获得测序结果,获结果率为96.8％.19枚优质卵裂期胚胎中,正常二倍体胚胎4枚,占21.1％;异常胚胎15枚,占78.9％,其中非嵌合型异常胚胎1枚(5.3％),嵌合型异常胚胎14枚(73.7％).92个卵裂球中,正常二倍体卵裂球43个,占46.7％;染色体异常卵裂球49个,占53.3％.结论:应用单细胞测序对优质卵裂期胚胎的染色体情况分析发现,卵裂期优质胚胎中可能存在较高的染色体异常,或许是影响胚胎种植率的重要因素之一.

目的 比较基因组杂交微阵列芯片(array CGH)与多次退火环状循环扩增二代测序(MALBAC NGS)两种方法进行胚胎植入前染色体筛查的结果差异. 方法 收集西北妇女儿童医院生殖中心行胚胎植入前遗传学筛查/诊断(PGS/PGD),并经array CGH(BlueGnome 24SureV3软件)检测异常的囊胚(共32枚),复苏培养后再次活检,通过MALBAC-NGS的方法进行胚胎染色体非整倍体筛查,比较两种不同检测方法的结果差异. 结果 32枚囊胚中,内细胞团与外胚层分别活检的有16枚,通过MALBAC-NGS的方法检测,内细胞团与外胚层检测结果完全一致的为14枚,一致率87.5％(14/16);2枚囊胚内细胞团与外胚层部分不一致,不一致率12.5％(2/16).32枚囊胚中,两种方法检测结果完全一致的有7枚,一致率21.87％(7/32);array CGH法检测为染色体异常的囊胚中,其中有15枚囊胚MALBAC-NGS法检测为正常(46XN),arrayCGH的假阳性率46.88％(15/32).array CGH法检测染色体嵌合的胚胎数为0,MALBAC-NGS检测出染色体嵌合的胚胎数为3枚,嵌合率9.37％(3/32). 结论 与array CGH法相比,MALBAONGS法检测能够降低假阳性率,嵌合检出率高.MALBAC-NGS法检测囊胚内细胞团与外胚层的整倍体一致性较高.

1 病例患者,男33岁,2013年结婚,婚后勃起及射精正常,性生活2-3次/周,未避孕女方至今未孕,曾于外院给予治疗1年仍未怀孕,女方检查未见异常.父母非近亲结婚,仅生育1子.本人从事汽车买卖工作,无不良接触史及不良嗜好.体检:身高167cm,体重68kg,外生殖器发育正常,双侧睾丸体积各约12ml,双侧精索静脉未触及异常.患者行外周血染色体检查核型45,X (26) /46XYqh+ (34),见图1,Y染色体微缺失正常,性激素提示:FSH:3.86IU/L,LH:2.29IU/L,T:3.21ng/ml,PRL:5.6ng/ml,E2:46pg/ml,我院及外院多次精液检查示:精液量6.1ml,精液离心可见精子2-3条精子/Hp,偶见活动精子.正常形态精子百分率为4％.对20条活精子行多次退火环状循环扩增技术(Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles,MALBAC)测序显示,正常单精子百分率为50％,23,X:23,Y精子比例约为5∶1,异常精子为24,XY、47,XYY等非单精子(图2见封二).

目的 通过对进行植入前遗传学筛查(PGS)患者的胚胎和染色体结果分析,比较不同PGS指征在胚胎染色体非整倍体的差异.方法 收集2018年6月1日至2018年11月30日在西北妇女儿童医院生殖中心行PGS患者288例,胚胎培养囊胚期活检,PGS检测采用多次退火环状循环扩增技术-二代测序技术(MALBAC-NGS),比较不同年龄段、不同性别患者和不同PGS指征胚胎染色体非整倍体率.结果 ①PGS共活检288枚胚胎,最终有效检出结果的胚胎数为275枚.其中整倍体胚胎数目为141(51.27％),非整倍体胚胎数目为134(48.73％).②在染色体异常的胚胎中以异常染色体数目为1条(42.54％)和2条(37.31％)最为常见.染色体异常的女性患者产生非整倍体胚胎数目为43个(59.72％),染色体异常的男性患者产生非整倍体胚胎数目为59个(49.17％),不同性别患者的整倍体率与非整倍体率比较无统计学差异(χ2=2.01,P>0.05).③随着女方年龄的增长,胚胎非整倍体率逐渐升高,≤27岁、28～30岁、31～33岁、34～36岁和≥37岁患者非整倍体胚胎数目分别为34个(43.04％)、43个(52.44％)、37个(59.68％)、10个(32.26％)、12个(57.14％).然而,不同年龄女性患者的胚胎整倍体率与非整倍体率比较无统计学差异(χ2=8.35,P>0.05).④在不同PGS指征中,以相互易位(36.84％)和复发性流产(RSA,占18.60％)最为常见.相互易位、罗氏易位、倒位、非整倍体及衍生染色体患者产生的非整倍体胚胎数目分别为71个(67.72％)、8个(40.00％)、2个(66.67％)、11个(42.31％)和7个(77.78％);不良孕产史、反复种植失败、RSA患者产生的非整倍体胚胎数目分别为11个(39.29％)、2个(22.22％)、24个(45.28％);不同PGS指征患者的整倍体率与非整倍体率比较具有统计学差异(χ2=23.94,P<0.05).⑤胚胎染色体异常中11、13、14、22号染色体及性染色体异常发生率较高(分别占9.19％、10.95％、6.71％、6.01％、8.83％).结论 通过对PGS患者的染色体结果分析得出,随着年龄的增长,胚胎非整倍体率逐渐升高.在不同PGS指征中,以相互易位和RSA最为常见.平衡易位、倒位、衍生染色体等双亲染色体异常可能更易导致胚胎染色体非整倍体.染色体异常的胚胎中以异常染色体数目为1条和2条最为常见.染色体异常的女性患者胚胎非整倍体率较高.

单细胞测序技术目前虽已广泛应用于人类、动物、微生物等物种的研究,但由于细胞壁的存在,使得该技术在植物上的应用举步维艰.如果能先分离出植物单条染色体,然后再应用单细胞测序技术进行扩增和测序,则可以避免细胞壁的干扰,从而具有重要的应用价值.虽然科研人员一直尝试针对单条植物染色体进行测序,但目前尚未见有成功的报道,也未见有文章对失败的原因进行讨论.该研究以六倍体中国春小麦为材料,针对使用单细胞测序技术进行单染色体扩增过程中出现的假阳性问题进行了探讨,分析了单染色体扩增失败的主要原因,并通过高通量测序技术研究了外源污染的可能来源.结果表明:在对实验器具、耗材、环境污染严格防控的基础上,人体接触可能是造成污染的主要来源;同时,推测单染色体之所以扩增失败可能是因为染色体自身超螺旋状态造成引物难以结合和复制.该研究还针对存在的问题提出了可行性建议,为将来成功进行单染色体测序提供了有益的借鉴.

目的 研究携带SLC26A4致病基因突变的家庭中,胚胎植入前遗传学诊断(PGD)技术在帮助实现孕育听力正常后代、阻断耳聋基因垂直传递中的效果.方法 采用单细胞全基因组扩增技术(MALBAC)、高通量测序技术及SNP分型技术,对5组夫妻双方均携带SLC26A4基因已知致病突变的家庭进行胚胎植入前遗传学诊断,挑选健康胚胎进行移植,在孕中期行羊水穿刺产前诊断基因型,新生儿出生后进行听力筛查.结果 5组家庭中,3组家庭经PGD成功受孕,其中家庭1、家庭2已生育听力正常的新生儿,家庭4仍在妊娠期;家庭3经一次PGD形成的胚胎均携带耳聋基因,后选择自然受孕,经产前诊断检测胎儿基因型为单杂合突变携带;家庭5经促排卵后未成功排卵而退出研究.结论 1.对于明确致病基因的家庭,PGD技术能够阻断耳聋基因的垂直传播,帮助生育健康胎儿;2.如果女方高龄,由于卵巢储备逐渐下降、对外源性促性腺激素的反应能力下降等原因,在PGD过程中失败风险高.

目的:对胚胎培养液筛查胚胎染色体进行初步探讨,为优质胚胎无创筛查体系提供数据和技术支持.方法:采集胚胎培养液86例和囊胚36例,其中56例为卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)胚胎培养液,30例为体外受精-胚胎移植(IVF-ET)胚胎培养液.采用基因测序通用文库试剂盒对囊胚及胚胎培养液进行MALBAC单细胞全基因组扩增及文库构建,运用高通量测序平台进行测序,运用ChromGoTM2.0数据分析平台检测染色体非整倍体及10M以上的片段缺失和(或)重复.结果:86例胚胎培养液中27例未检出染色体核型,其中前期收集36例标本,检出成功率41.7％;改进方法收集50例标本,检出成功率88.0％.对36例囊胚及其培养液染色体结果进行对比,IVF-ET 18例,染色体倍性一致率38.9％,非整倍体假阳性率50.0％,假阴性率0.0％;ICSI-ET 18例,染色体倍性一致率77.8％,非整倍体的假阳性率16.7％,假阴性率5.6％.结论:ICSI-ET受精方式在胚胎培养液用于胚胎染色体的筛查中优于IVF-ET;建立完善的培养液收集流程利于胚胎染色体检测.