目的:探讨单精子测序技术在新发突变单基因病家系胚胎植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing，PGT）中的应用效果和价值。方法:针对3个携带新发突变的常染色体遗传病家系，采用多重置换扩增技术（multiple-displacement amplification，MDA）对单精子进行全基因组扩增（whole genome amplification，WGA），通过检测扩增产物的变异位点以及目的基因上下游2M范围内有效单核苷酸多态性位点（single nucleotide polymorphism，SNP）位点信息，构建携带突变的风险单体型与不携带突变的正常单体型。对待测胚胎进行WGA，产物进行高通量测序，结合单体型信息判断胚胎致病位点的携带状态，选择不携带致病变异的胚胎进行移植。结果:共挑取16份有效单精子样本，在原发性高草酸尿症、Kabuki综合征、遗传性大疱性表皮松解症3个新发突变单基因病家系中成功构建单体型。胚胎植入前单基因遗传病检测（PGT for monogenic disorders，PGT-M）结果提示有10枚胚胎携带父源致病变异；6枚胚胎不携带父源致病变异，其中2枚胚胎检出染色体拷贝数变异。除原发性高草酸尿症夫妇外，其余两个家系的夫妇共获得4枚正常胚胎，移植后均未妊娠。结论:对于家系中男性携带新发突变的夫妇，可以利用单精子测序技术构建单体型，进而进行PGT。

目的 研究α地中海贫血患者囊胚活检后先进行全基因组扩增后再应用荧光PCR进行诊断的效果. 方法 回顾分析本中心2015年1月至2016年11月α地中海贫血PGD周期资料,共139个周期,对比分析卵裂球活检后直接应用荧光PCR进行诊断(诊断方法一)与囊胚活检后先进行全基因组扩增后再应用荧光PCR进行诊断(诊断方法二)的结果. 结果 两组在女方年龄、获卵数、正常受精数均无统计学差异(P＞0.05),但方法二(7.61±3.05)的平均活检个数显著小于方法-(9.48±3.66) (P＜0.05).两种方法的正常胚胎率(35.22％ vs.25.87％)、杂合子胚胎率(30.11％ vs.50.19％)、异常胚胎率(30.11％ vs.23.94％)、诊断失败率(16.21％ vs.2.81％)有统计学差异(P＜0.05),临床妊娠率(50.00％ vs.52.17％)无统计学差异(P＞0.05). 结论 囊胚活检后先进行全基因组扩增后再应用荧光PCR进行诊断的效果明显好于卵裂球活检后直接应用荧光PCR进行诊断.

目的 阐明不明原因发热(fever of unknown origin,FUO)的血液样本中用常规方法难以检测到的潜在病原.方法 利用二代测序技术序列非依赖的特性对病原核酸进行随机捕获,随后采用多重链置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)方法进行富集.在得到测序结果后,进行宏基因组数据分析,构建进化树,最终实现对未知病原的鉴定.结果 对10份不明原因发热的血液样本进行宏基因组二代测序分析时未发现引起发热的常见病原体序列,但发现了大量人细环病毒(Torque teno Virus,TTV)存在的现象.将所有相关测序读长进行组装拼接,并计算得到的一致性序列在匹配的参考序列上的基因组覆盖度.在对组装出的置信序列进行进化分析后,发现其分属于αTTV、β TTV和γ TTV三个属.结论 对本研究中发现的TTV的基因组特征、进化特征以及作为免疫水平评估的意义进行了分析.而对于本研究中只检测出三个属的TTV的现象,可能是因为TTV具有潜在的病原性以及感染性疾病所导致的宿主免疫水平低下,也有可能是由于其他非感染性病因导致的宿主免疫水平降低所导致.

单细胞全基因组扩增(whole genome amplification,WGA)是指在单细胞水平对全基因组进行扩增的新技术,其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增,获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序,用于揭示细胞异质性.目前,WGA方法主要包括引物延伸预扩增(primer extension preamplification PCR,PEP-PCR)、简并寡核苷酸引物PCR(degenerate oligonucleotide primed PCR,DOP-PCR)、多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)、多次退火环状循环扩增(multiple annealing and looping-based amplifica-tion cycles,MALBAC)等.本文对不同的单细胞WGA方法的原理及应用情况分别进行了阐述,并对其扩增效率进行评价和比较,包括基因组覆盖度、均一性、重现性、SNV(single-nucleotide variants)和CNV(copy number variants)检测力等.综合对比不同单细胞WGA方法后发现,MALBAC的扩增均一性最高、等位基因脱扣率最低、重现性最好,且对于CNV和SNV的检测效果最好.本文还阐述了MALBAC技术在人类单精子减数重组、非整倍体分析以及人类卵细胞基因组研究中的应用.

目的 建立人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)基因配型,为开展HLA配型的胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)联合或不联合单基因病的临床工作提供技术支持.方法 采用多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)的方法扩增3～5个滋养层细胞的全基因组,并用多重聚合酶链式反应(PCR)方法扩增多个短串联重复多态性(polymorphic short tandem repeat,STR)位点,通过毛细管电泳技术验证STR位点的特异性.结果 微量细胞全基因组的扩增成功率为93.75％,筛选了HLA基因的5个杂合度高、特异性强的STR位点,等位基因脱扣(allele drop-out,ADO)率为10.34％.结论 微量细胞MDA结合多重PCR的方法可以同时检测HLA-A、HLA-B、DRA、DQB位点,扩增成功率高,ADO率低,可以有效地筛选出相匹配的胚胎,为同胞患儿提供造血干细胞来源具有可行性.

目前国家要求将耳聋等遗传性疾病列入出生缺陷综合防控方案,建立涵盖孕前、孕期和新生儿各阶段的出生缺陷防治免费服务制度.本文对6个通过国家食品药品监督局批准的耳聋基因筛查试剂盒检测特点、近年来获得耳聋基因筛查专利的检测方法、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术、测序技术、全外显子组测序技术、多重置换扩增技术、单核苷酸多态分型技术以及胚胎植入前遗传学诊断技术等相关耳聋基因检测技术应用和研究现状进行综述.

目的 建立一种基于囊胚细胞全基因组扩增(WGA)结合目的序列短片段Gap-PCR基因分型技术的α-地中海贫血东南亚型(SEA)缺失突变快速植入前遗传学诊断新方法.方法 以多重置换扩增(MDA)WGA技术为基础,建立以管家基因GAPDH和β-actin为目的序列的WGA产物双重荧光PCR质检体系,以及突变和正常序列短片段Gap-PCR的α-地中海贫血SEA缺失基因分型体系,通过对不同细胞数SEA携带者淋巴细胞样本的检测进行灵敏度与准确性评价,对12例囊胚活检样本的检测进行应用评价.结果 应用本研究建立的方法,不同淋巴细胞数样本的结果显示3细胞时即未出现等位基因脱扣,4细胞时目标模板的WGA产物量趋于稳定;10例WGA成功的囊胚活检样本的基因分型结果分别为--SEA/αα(5例)和αα/αα(5例),与验证基因型相符.结论 本研究建立的方法为一个完整检测流程,即以4～6个囊胚活检细胞为检材,对MDA产物进行WGA质检及相对浓度评估后,以短片段Gap-PCR体系而实现α-地贫SEA缺失的PGD快速基因分型;此方法简单快速、结果准确、检测成本低而适合临床常规应用.

目的 评估REPLI-g?Single Cell Kit应用于检材DNA扩增的效率,探讨该试剂盒在法医学微量DNA扩增方面的应用价值.方法 选取3种微量DNA提取试剂盒,对来自10名无关个体的外周血进行DNA提取,并对所提DNA的产量和纯度进行比较.根据比较结果选取1例DNA样本进行浓缩稀释作为全基因组扩增起始样本,使用REPLI-g?Single Cell Kit对起始样本进行全基因组扩增,计算扩增产量及扩增倍数,并进行琼脂糖凝胶电泳检测片段分布情况.使用Goldeneye?DNA身份鉴定系统20A对起始样本和经全基因组扩增所得DNA进行STR分型.结果 经比较后选取由QIAsymphony?DNA Investigator?Kit所提取的1例DNA进行浓缩稀释作为全基因组扩增起始样本.经REPLI-g?Single Cell Kit对一系列起始样本全基因组扩增后,发现扩增产量均值最低可达到8.77×103 ng,相应的扩增倍数均值为1.40×106,DNA片段大且集中.全基因组扩增样本随着起始样本量的减少,STR分型成功率降低,但当起始样本量低于0.5 ng时,全基因组扩增后样本的STR分型成功率高于相同起始量未经全基因组扩增样本的STR分型成功率.结论 应用REPLI-g?Single Cell Kit可有效提高模板DNA总量,特别对于微量DNA,可在一定程度上提高STR分型成功率.

目的 通过多重置换扩增技术(multiple displacement amplification,MDA)与宏基因组鸟枪法测序相结合的方法研究胃癌患者和健康受试者胃内微生物的组成特征.方法 纳入2017年9月—2017年12月在医院就诊的胃腺癌患者4例,健康受试者4例,收集受试者胃液标本,经过标本预处理、DNA提取、MDA扩增提取的DNA、构建测序文库、高通量测序和生物信息学分析,研究2组受试者胃内微生物的组成特征,寻找与胃癌显著相关的菌种,并评估该方法用于胃内微生物宏基因组学研究的可行性.结果 MDA能显著扩增从胃液样本中提取的微量微生物DNA(207.27±33.17)倍,扩增后的DNA量能满足构建高质量测序文库的要求;总体上看,所有样本共鉴定出131个菌种,胃癌患者胃内菌群多样性显著低于健康受试者(P<0.01,t=4.189);在细菌门水平,受试者胃液菌群主要由变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门组成;优势物种的组间差异分析表明,与健康受试者相比,牙髓卟啉单胞菌、口腔链球菌、干燥奈瑟菌在胃癌患者胃液中富集(P<0.05).结论 MDA能有效用于扩增胃内微量微生物DNA;胃癌患者的胃液菌群构成与健康人存在显著差异;部分口腔及上呼吸道条件致病菌与胃癌显著相关,是潜在的胃癌生物学标志物;通过全基因组扩增和高通量测序相结合的方法可以从菌种甚至菌株的水平上寻找与胃癌发生、发展相关的微生物.

目的 建立一种可视化的恒温扩增方法用于检测脓肿分枝杆菌(MAB).方法 采用特异性全长erm (41)基因建立基于多交叉置换扩增(MCDA)结合羟基萘酚蓝(HNB)的方法,通过比色法直接检测扩增产物,采用23株脓肿分枝杆菌复合群和8种细菌标准株对该方法进行初步评价.结果 建立的MAB-MCDA-HNB检测限为100 fg的DNA模板.31株细菌菌株中,只有脓肿分枝杆菌检测结果为阳性,其它细菌包括结核分枝杆菌,卡介苗,马赛分枝杆菌、鸟分枝杆菌等非结核分枝杆菌和金黄色葡萄球菌等均为阴性.脓肿分枝杆菌模拟痰标本检测灵敏度为1.7×103 CFU/mL(每次反应17 CFU).结论 MAB-MCDA-HNB方法能够快速准确诊断脓肿分枝杆菌的感染.