为探究急性温度胁迫对红耳龟Trachemys scripta elegans消化和免疫功能的影响及饲料添加维生素E(VE)的干预效应.选取健康2龄红耳龟112只,分成未添加VE组和添加VE组(250 mg·kg-1),每组设室温(30℃)、低温(17℃)和高温(35℃),于胁迫0 h、6 h、12 h取血液和肠道组织,检测血清抗氧化酶和肠道消化酶活性.结果表明,未添加VE组低温下淀粉酶和脂肪酶的活性显著上升,谷胱甘肽(GSH)含量显著降低,高温下胃蛋白酶活性极显著升高,超氧化物歧化酶(SOD)活性显著升高,GSH含量显著下降;添加VE组急性温度胁迫下的SOD活性升幅减小,GSH含量升高,低温下胃蛋白酶活性显著提高,脂肪酶活性显著降低;高温下胃蛋白酶活性极显著降低,淀粉酶活性显著升高.本研究初步阐释了急性温度胁迫对红耳龟的损伤机制,同时发现饲料添加VE具有一定程度的缓解作用,为生产中应对急性温度应激探索了一条绿色可行途径.

为掌握广东南雄小流坑-青嶂山省级自然保护区两栖爬行动物多样性现状,2016年4月至2017年9月,采用野外与访问调查法,对该保护区的两栖爬行类进行了专项调查.目前,该保护区已记录两栖爬行类共4目25科95种,约占广东省两栖爬行类物种数的41％,其中两栖类2目9科30种,爬行类2目16科65种;包括国家I级重点保护野生动物蟒(Python bivittatus),国家II级重点保护野生动物虎纹蛙(Hoplobatrachus chinensis)、三线闭壳龟(Cuora trifasciata).本次调查发现该保护区两栖爬行类物种新纪录47种,其中两栖类新纪录12种,爬行类新纪录35种.目前,该保护区内的两栖爬行动物仍面临一定的盗猎压力和栖息地破坏的威胁.此外,在该保护区还发现外来危险物种红耳龟(Trachemys scripta elegans).基于本调查研究结果,对该保护区的两栖爬行类多样性及其保护问题进行了分析和探讨,并提出了4点保护管理建议.

在一些爬行动物中,个体的性别完全取决于胚胎发育过程中的环境温度,称之为温度依赖型性别决定(temperature-dependent sex determination,TSD).TSD的分子机制长期是个谜,特别是调控早期性腺分化的分子基础仍不清楚.本文通过表达分析和基因敲低手段研究了Sox9基因在红耳龟雄性性腺分化中的生物学功能,为TSD动物的性别决定和性腺发育的分子机制的研究奠定了基础.qRT-PCR显示,从性腺分化前的17期起,Sox9呈现产雄温度(male-producing temperature,MPT)性腺特异性高表达,而在产雌温度(female-producing temperature,FPT)性腺中表达水平极低.免疫组化进一步证实了SOX9蛋白的MPT特异性表达趋势,其定位于Sertoli前体细胞核中.温度置换实验显示,与MPT性腺相比,MPT--FPT性腺中(16期置换)的Soχ9表达量从17期起就显著降低,表明Sox9能快速响应温度变化.同时MPT性腺经过雌激素处理后,Sox9表达量亦快速下调.功能缺失研究显示,经过Sox9-RNAi处理后,90.9％(20/22)的MPT性腺结构明显雌性化,皮质区高度发育,髓质区退化,揭示Sox9的敲低能导致雄性向雌性性逆转.上述研究表明,Sox9是红耳龟早期睾丸分化的关键调控因子,参与TSD的雄性分化通路.

目的 描述北京市首例由长湾泥沙门菌引起的感染性腹泻病例的发病就诊过程和流行病学特征,为有效防控此类病例的发生提供依据.方法 通过中国疾病预防控制信息系统及时发现病例,对该病例进行流行病学调查,采集病例的血液和粪便标本进行实验室检测,根据流行病学调查资料分析可能存在的危险因素.结果 患儿女性,6月龄,2017年6月15日因发热、呕吐和腹泻等症状人院治疗,经北京市疾病预防控制中心检测患儿为长湾泥沙门菌阳性(Salmonella Jangwani,17∶a∶1,5).流行病学调查显示,巴西红耳龟可能是造成本次感染的传染源,经污染环境和手的接触传播可能是造成本次感染的传播途径,患儿日常护理卫生情况可能是危险因素.结论 该病例是北京市首例由长湾泥沙门菌引起的感染性腹泻病例;同时这一菌株的发现对增加北京市沙门菌血清型的多样性和生物溯源研究具有重要的公共卫生学意义;对此病例开展的流行病学调查和实验室检测,为今后对此类腹泻疫情的规范处置提供了依据.

红耳龟(Trachemys scripta elegans)是世界上最危险的100种入侵物种之一,该种对环境适应能力极强.目前尚未见有关红耳龟细胞体外培养的研究报道,本研究旨在探索和建立快速稳定的红耳龟胚胎成纤维细胞分离培养体系,为进一步从细胞层面研究红耳龟对极端环境的耐受机制提供材料和方法支撑.本研究取发育至13或14期的红耳龟胚胎,采用酶消化法和差速贴壁法获得红耳龟胚胎成纤维细胞,在体外进行原代培养和传代培养;采用噻唑蓝(MTT)比色法分别绘制红耳龟胚胎成纤维细胞在不同温度、接种浓度和血清浓度下的生长曲线;采用反转录PCR对培养的红耳龟胚胎成纤维细胞进行分子水平的鉴定;采用脂质体转染法对红耳龟胚胎成纤维细胞进行基因转染.结果表明:1)红耳龟胚胎成纤维细胞呈典型的梭形、不规则星形或多边形,达到一定密度时呈多层生长,排列紊乱,随着传代次数的增加,细胞体积增大,梭形细胞有拉长趋势,细胞可至少传至15代;2)红耳龟胚胎成纤维细胞在30～34℃条件下的生长状态良好,其生长速率随着温度的升高而增高;其接种密度不宜低于1.25×104个/cm2;其最佳血清浓度为10％;3)反转录PCR检测到成纤维细胞标记基因vim和acta2在红耳龟胚胎成纤维细胞中表达;4)脂质体转染法可以介导外源绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白进入到红耳龟胚胎成纤维细胞内表达,转染效率约为30％.本研究成功地在体外分离培养了红耳龟胚胎成纤维细胞,该细胞系可应用于外源基因转染和表达.

外来有害入侵物种红耳龟(Trachemys scrota elegans),原属于淡水龟类,但目前研究发现其可存活于半咸水环境中,这使得未来红耳龟可入侵的潜在范围及危害将增大.为了探究红耳龟对盐度适应的分子机制,本研究应用高通量转录组测序技术,分析其在不同盐度环境中参与离子调节的主要基因及通路.我们设计了三个处理组:对照组(自来水)、低盐度组(0.5％,即盐度5组)和高盐度组(1.5％,即盐度15组),慢性胁迫8周后,分析血液中无机离子、葡萄糖及皮质醇含量,并对其肝脏转录组数据进行分析.结果表明,与对照组相比,盐度5组血液渗透压、[Na+]和血糖差异不显著(p＞0.05),而盐度15组显著升高;血液[Cl-]三组间差异均显著;两个盐度处理组血液[K+]显著低于对照组(p＜0.05);但血液皮质醇含量在三组之间差异均不显著.GO (Gene ontology)富集分析发现,参与离子调节的基因主要有电压门控钾通道亚家族5(KCNH5)、电压门控钠通道Ⅰ (SCN1B)、利尿肽前体A(NPPA)、ATP酶(ATPeFOA,MTATP6,ATP6)、葡萄糖激酶(GCK)、盐诱导激酶(sIK)、脂联素(ACDC)和类固醇17α-单氧酶(CYP17A)等.所筛选出的基因大多被富集到与能量代谢、脂肪代谢、碳水化合物代谢以及内分泌系统等KEGG通路类别中.综上所述,红耳龟在盐度适应过程中参与离子调节的大部分KEGG通路以及相关的生理指标均未发生显著变化,说明它能较好地适应慢性低盐度胁迫(盐度0.5％左右).

外源性激素在中华鳖(Pelodiscus sinensis)性别决定有重要作用,为给中华鳖性别决定机制研究提供生物学信息,首次克隆和分析了中华鳖Foxl2 cDNA部分序列.为研究其在遗传和生理水平的差异,以10 mg/kg剂量17α-甲基睾酮(MT)和17β-雌二醇(E2)分别对中华鳖雌雄个体注射,检测0、6h、12h、24h、48h、7d和14d性腺Foxl2 mRNA表达水平.获得中华鳖Foxl2基因(GenBank登录号:KP734210)部分cDNA长903 bp,共编码300个氨基酸,属于叉头框转录因子家族,参与卵巢发育和功能维持;多重序列比对显示,Foxl2具有典型的FH结构域,与红耳龟的同源性最高,达到99％;系统进化树分析显示,中华鳖Foxl2基因与爬行动物Foxl2基因聚为一个亚支,且与西部锦龟Foxl2基因距离最近.荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,注射E2后24h,卵巢Foxl2 mRNA表达水平被极显著上调(P＜0.001),7d和14d后,精巢Foxl2 mRNA表达水平极显著上升(P＜0.001);注射MT后24h,精巢和卵巢Foxl2 mRNA的表达水平均极显著升高(P＜0.001).结果表明,E2和MT促进oxl2表达,E2促进其表达的性别差异比MT明显.研究可为了解Foxl2的功能及明确外源性激素调控中华鳖Foxl2的分子机制提供基础资料.

咬合力是动物生态适应性的重要体现,而形态特征通常能反映咬合力的大小.为研究红耳龟Trachemys scripta elegans咬合力性二型及其与形态的关系,采用力值传感器测定了雌性(n=16)和雄性(n=14)红耳龟的咬合力,分析了雌雄个体间咬合力的差异及其与形态指标(体质量、背甲长、头长、头宽、头高)的相关性.结果 显示,雌性红耳龟的咬合力(71.92 N±15.59 N)显著大于雄性(55.24 N±10.09 N) (P =0.047);雌性红耳龟体质量、背甲长和头宽也显著大于雄性;咬合力与形态存在显著的线性关系(P＜0.05).结果 表明,红耳龟的咬合力具有性二型,咬合力的分化可能与形态特征的性二型有关.雌性红耳龟较大的咬合力有助于提高取食效率,以满足大体型及繁殖的能量需求,从而提高了自身的适合度.

为研究环境依赖型性别决定的分子机制,研究把温度依赖型性别决定(Temperature sex determination,TSD)的黄喉拟水龟(Mauremys mutica)Dmrt1基因作为研究对象,通过黄喉拟水龟雌雄性腺转录组数据筛选和克隆了Dmrt1 cDNA全长序列,RACE-PCR结果显示该序列全长1811 bp,包括3′端非编码区572 bp,开放阅读框1110 bp,共编码370个氨基酸.氨基酸序列多重比对显示,黄喉拟水龟Dmrt1基因与红耳龟(Trachemys scripta)同源性最高,达97.57%;与中华鳖(Pelodiscus sinensis)Dmrt1同源性达75.54%.与小鼠(Mus musculus)Dmrt1同源性达63.25%,与中华鲟(Acipenser sinensis)Dmrt1同源性最低,为21.62%.定量PCR(RT-qPCR)结果显示,Dmrt1在成年黄喉拟水龟卵巢中表达较少,在精巢中表达较为明显,但其他体组织中表达量极少,且Dmrt1在25℃产雄温度下胚胎发育的19—22期表达量逐步增加且显著高于32℃产雌温度下表达量.原位杂交分析显示,黄喉拟水龟Dmrt1主要在支持细胞中表达,在精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞中有少量表达.以上研究结果表明,Dmrt1基因可能参与黄喉拟水龟性别决定和雄性性腺分化过程,参与雄性性腺的发育过程,研究为进一步揭示黄喉拟水龟温度依赖型性别调控机制奠定了基础.

为探究红耳龟Trachemys scripta elegans对植物血凝素(PHA-P)的反应峰值及其与血液指标的关系,以及温度对其反应模式的影响,测定了22℃、最适注射浓度条件下注射前和到达峰值时,血液中各型白细胞的百分比和血浆杀菌能力,以及经20℃、24℃、28℃和32℃处理6周后,红耳龟对PHA-P最适注射浓度的反应模式.结果 显示,22℃下经1.0g·L-1、2.5g·L-1和5.0g·L-1浓度PHA-P处理后,分别在注射后24 h、48 h和24 h到达反应峰值.选2.5g·L-1为最适注射浓度,达峰值时淋巴细胞的百分比显著升高(P＜0.05),其他类型白细胞的百分比、嗜中性粒细胞与淋巴细胞的比值及血浆杀菌能力注射前后的差异均无统计学意义(P＞0.05);20℃、24℃、28℃和32℃组分别处理6周后,红耳龟对PHA-P的反应峰值见于48 h、24h、24 h和24 h,峰值间的差异无统计学意义(P＞0.05);注射后24～48 h,20℃组的反应值升高,32 ℃组下降,24℃和28℃组保持相对稳定,但差异均无统计学意义(P＞0.05).红耳龟对PHA-P的反应峰值与淋巴细胞数量增加有关,在其适宜生存的温度范围内随温度升高而前移,可以通过预先激活适应性免疫能力来提高红耳龟对高温的适应能力.