目的:建立人真皮成纤维细胞（HDF）高糖老化模型，探讨人蜕膜间充质干细胞（dMSC）来源外泌体对高糖老化HDF增殖、迁移、凋亡的影响及其可能机制。方法:采用实验研究方法。收集2021年1—3月解放军总医院第四医学中心收治的4例男性包茎患者（18~22岁）环切术后废弃包皮组织，分离培养获取原代HDF。取第6代HDF，按照随机数字表法分为低糖组和高糖组，分别采用低糖完全培养基和高糖完全培养基进行每72小时换液、不传代培养，10 d后取细胞，于接种后24 h，采用β-半乳糖苷酶试剂盒检测细胞衰老情况；于接种后48 h，采用蛋白质印迹法检测细胞衰老相关蛋白p16、p53表达情况；于接种后24、48、72 h，采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测细胞增殖情况；于接种后48 h，采用脱氧尿嘧啶核苷（EdU）染色法检测细胞增殖情况，采用流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况；于接种后24 h，采用Transwell实验测定细胞迁移能力。取人dMSC培养48~72 h，采用差速高速离心法获取其外泌体，采用透射电子显微镜观察dMSC外泌体形态，采用纳米颗粒追踪分析法检测dMSC外泌体的粒径分布，采用蛋白质印迹法检测dMSC外泌体标志蛋白CD9、肿瘤易感基因101（TSG101）的表达。取dMSC外泌体及前述高糖完全培养基诱导老化的HDF共孵育24 h，采用PKH67试剂盒检测细胞摄取外泌体的情况。取前述高糖完全培养基诱导老化的HDF，同前分为单纯高糖组、高糖+低浓度外泌体组、高糖+高浓度外泌体组，分别于高糖完全培养基中加入等体积的磷酸盐缓冲液、终质量浓度为50 μg/mL dMSC外泌体、终质量浓度为100 μg/mL dMSC外泌体进行常规细胞培养。分组后同前于对应时间点采用CCK-8法和EdU染色法、流式细胞术、Transwell实验分别检测细胞增殖、细胞周期和凋亡及细胞迁移情况。根据前述结果，另取经高糖完全培养基诱导老化的HDF，分为单纯高糖组、高糖+高浓度外泌体组并同前处理。分组培养48 h，采用实时荧光定量反转录PCR法检测单纯高糖组和高糖+高浓度外泌体组细胞衰老相关的微小RNA-145-5p（miR-145-5p）、miR-498、miR-503-5p及其靶基因钙/钙调素依赖性蛋白激酶1D（CAMK1D）、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（ PTEN基因）和细胞周期蛋白D1的mRNA表达情况。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD- t检验和独立样本 t检验。 结果:接种后24 h，高糖组HDF β-半乳糖苷酶阳性染色率为（38.4±4.2）%，明显高于低糖组的（16.5±2.2）%（ t=4.65， P<0.01）。接种后48 h，高糖组HDF的衰老相关蛋白p16和p53的表达量均明显高于低糖组（ t值分别为11.85、3.02， P<0.05或 P<0.01）。接种后24、48、72 h，高糖组HDF的增殖活性均明显低于低糖组（ t值分别为4.13、9.90、15.12， P<0.01）。接种后48 h，高糖组HDF的EdU阳性染色率明显低于低糖组（ t=3.83， P<0.05）。接种后48 h，高糖组HDF周期的G2/M+S亚群在3个亚群（G0/G1、S和G2/M）的占比明显低于低糖组（ t=8.74， P<0.01）。接种后24 h，高糖组HDF穿过Transwell滤膜到达下室的细胞数量为（37±6）个，明显少于低糖组的（74±7）个（ t=8.42， P<0.01）。接种后48 h，高糖组HDF凋亡率明显高于低糖组（ t=8.48， P<0.01）。dMSC外泌体为边缘清晰、大小分布均匀的杯状或者圆形囊泡，粒径基本处于80~200 nm。dMSC外泌体标志性蛋白CD9、TSG101表达均呈阳性。共孵育24 h，外泌体被HDF摄入胞内，主要分布于细胞核周围。分组培养24、48、72 h，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF增殖活性均明显高于单纯高糖组（ t值分别为6.36、6.10、7.76，8.92、12.17、10.74， P<0.01），高糖+高浓度外泌体组HDF增殖活性均明显高于高糖+低浓度外泌体组（ t值分别为7.92、4.82、4.72， P<0.01）。分组培养48 h，与单纯高糖组比较，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF EdU阳性染色率均明显升高（ t值分别为5.32、9.88， P<0.01）；与高糖+低浓度外泌体组比较，高糖+高浓度外泌体组HDF EdU阳性染色率显著升高（ t=5.27， P<0.01）。分组培养48 h，与单纯高糖组比较，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF中的G0/G1期亚群占比均显著降低（ t值分别为3.81、4.31， P<0.05），G2/M+S亚群占比均明显升高（ t值分别为3.81、4.31， P<0.05）。分组培养24 h，与单纯高糖组相比，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF穿过滤膜的数量均明显增多（ t值分别为10.14、13.39 ，P<0.01）；与高糖+低浓度外泌体组相比，高糖+高浓度外泌体组HDF穿过滤膜的数量明显增多（ t=6.27 ，P<0.01）。分组培养48 h，与单纯高糖组比较，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF凋亡率均明显降低（ t值分别为3.72、5.53， P<0.05或 P<0.01）。分组培养48 h，与单纯高糖组相比，高糖+高浓度外泌体组HDF的miR-145-5p、miR-498 mRNA表达量均明显上升（ t值分别为13.03、8.90， P<0.01），miR-503-5p mRNA表达量明显下降（ t=3.85， P<0.05）；高糖+高浓度外泌体组中HDF的CAMK1D、 PTEN基因mRNA表达量均明显低于单纯高糖组（ t值分别为8.83、5.97， P<0.01），细胞周期蛋白D1 mRNA表达量明显高于单纯高糖组（ t=4.03， P<0.05）。 结论:人dMSC来源外泌体可显著提高高糖老化HDF的增殖和迁移能力，抑制其凋亡。这可能与HDF内miR-145-5p和miR-498表达增高抑制了CAMK1D和 PTEN基因的表达及miR-503-5p表达下降促进了细胞周期蛋白D1的表达有关。

目的:分析镀碳基纳米多层膜钛合金球头五百万次摩擦磨损实验产生的颗粒特征，并与钴铬钼合金（CoCrMo）球头对比，以评估新型镀膜球头摩擦磨损性能的优劣。方法:根据球头种类不同，将髋关节摩擦磨损实验设置为3组：A、C组分别选用进口及国产的CoCrMo球头，B组选用镀碳基纳米多层膜的钛合金球头（Ti 6Al 4V）。所有球头均与相同的超高分子量聚乙烯（UHMWPE）髋臼杯配伍。3组关节在髋关节模拟机运行五百万次后收集血清样本，消解稀释后依次通过5 μm、1.2 μm及0.4 μm的滤膜过滤。使用扫描电镜在滤膜上随机选取颗粒图像，确定颗粒元素种类及成分结构，计算颗粒的大小、形状、数量及体积等相关参数，比较组间相关参数的差异，以评估新型镀膜球头摩擦磨损性能。 结果:各组颗粒主要成分均为UHMWPE，且多为亚微米级（粒径<1 μm），B组亚微米级颗粒占比为49.4%，显著低于A组的75%及C组的60%（χ 2=66.032、31.754，均 P<0.017）。各组颗粒均以类圆形为主，形状相关参数纵横比（AR）组间无统计学差异（χ 2=0.590， P=0.744）。B组颗粒数量在全部滤膜上均明显少于C组（ t=9.960、8.019、5.790，均 P<0.01），在0.4 μm滤膜上显著少于A组（ t=7.810， P=0.000）。 结论:新型镀碳基纳米多层膜钛合金球头摩擦磨损性能明显优于国产球头，部分超过进口球头水平，对预防UHMWPE颗粒诱导的骨溶解和无菌性松动有积极作用。

目的 探讨在间充质干细胞上清液中分离纯化小细胞外囊泡的优化方法.方法 对比差速离心[differential(ultra)centrifugation,dUC]、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀和QIAGEN试剂盒法3种标准细胞外囊泡分离程序,并基于标准程序分别进行超滤浓缩、0.22μm滤膜过滤或0.45 μm滤膜过滤改良方案提取小细胞外囊泡,通过比较各分离方法的操作时长和简易程度,并分别用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析技术(nanoparticle tracking analysis,NTA)和Western blot评估小细胞外囊泡的形态结构、粒径分布和标志蛋白表达情况,分析各分离方法提取的小细胞外囊泡质量和效率.采用CCK-8实验和Transwell迁移实验评估改良方法提取的小细胞外囊泡对乳腺癌细胞增殖和迁移能力的影响.结果 dUC法、PEG沉淀法和QIAGEN试剂盒法3种分离方法均可分离出小细胞外囊泡,其中QIAGEN试剂盒法操作时长最短,平均为48 min,添加超滤浓缩步骤后延长至93 min(P＜0.0001).PEG沉淀法的操作时间最长,平均为487 min,添加超滤浓缩步骤后延长至547 min(P＜0.0001).dUC法平均操作时间为217 min,添加超滤浓缩步骤后延长至274 min(P＜0.0001).各样本在透射电镜下均观察到典型的"茶托"样结构,粒径分布范围除QIAGEN试剂盒法在200 nm以上,其余均在30-200 nm之间,其中dUC+0.45 μm滤膜过滤组一个视野中观察到的小细胞外囊泡典型结构最多且最完整.Western blot检测结果显示各方法提取的样本中均有阳性标志蛋白CD9、CD63、TSG101表达,不表达阴性标志物calnexin,但0.22 μm滤膜过滤后,各方法的小细胞外囊泡标志蛋白条带均变浅.NTA结果显示,dUC+0.45 μm滤膜过滤的小细胞外囊泡占比最高,达94.86％.不同方法提取的样本的粒径分布图显示,dUC法标准流程和dUC+0.45μm滤膜过滤组的NTA结果显示为单峰,曲线流畅.取dUC+0.45 μm滤膜过滤的样本进行乳腺癌细胞表型实验,结果显示,细胞增殖和迁移能力均增强(均P＜0.05).结论 dUC法是一种有效的间充质干细胞小细胞外囊泡分离方法,在进行超速离心前对细胞上清液进行0.45μm滤膜过滤,可以提高小细胞外囊泡的质量.

目的 研究超高温瞬时、臭氧与高温煮沸不同杀菌方法对饮用水的水质理化特性与微生物指标的影响.方法 2022年选择某包装公司生产线饮用水30 L纳入本研究,将纳入的水样本随机分成超高温组(n=10 L)、臭氧组(n=10 L)与煮沸组(n=10 L),进行平行检测.核磁共振波谱法测定3组水样的分子团大小,采用有机聚合物生成反应原理测定氢自由基浓度,3组水样的导电率采用电极法测定,溴酸盐含量采用离子色谱法测定,分别采用滤膜法和平板计数法对铜绿假单胞菌和大肠菌群进行检测.结果 煮沸组的水样分子团最高,为(134.47±8.21)Hz,其次为臭氧组的(120.84±9.37)Hz,最低为超高温组,为(89.52±4.95)Hz;超高温组的氢自由基为(0.365±0.021)mmol/L,其次为煮沸组的(0.321±0.019)mmol/L,最低为臭氧组,仅为(0.226±0.014)mmol/L;煮沸组水样导电率最高,为72.8％,其次为臭氧组,为52.1％,超高温组水样导电率最低,仅为48.6％;3组水样溴酸盐含量均不足0.005 mg/L;经3种杀菌方案处理后各组水样中均未发现铜绿假单胞菌和大肠菌群.结论 超高温瞬时、臭氧与高温煮沸杀菌均可对饮用水水质理化特性产生一定的影响,但超高温瞬时杀菌方案能够缩小水样分子团,提高氢自由基浓度,杀菌效果理想.

[背景]候选门级辐射类群(candidate phyla radiation,CPR)和DPANN是与绝大多数已知细菌和古菌具有显著差异的独特类群,因发现较晚,人们对其认识还非常有限.已知二者类群庞大、存在广泛,但在不同生境中的多样性研究还较少,生态功能尚属未知.[目的]分析不同地下水中CPR和DPANN的多样性,探讨不同方法对 CPR和DPANN检出及富集的影响.[方法]采用0.1 μm 滤膜收集菌体和宏基因组测序的方法分析呼和浩特市周边 4 个不同地下水中 CPR 和DPANN的多样性.比较宏基因组测序与 16S rRNA基因扩增子测序对CPR和DPANN检出的影响,以及不同过滤方式和不同滤膜组合对CPR和DPANN富集的作用.[结果]4 个地下水样品CPR 类群检出 33-64 个菌门,相对丰度在 0.17%-1.67%之间;DPANN检出 1-7 个菌门,相对丰度在 0.000 93%-0.071 00%之间.对于CPR和DPANN,16S rRNA基因V3-V4 区扩增子测序仅检出了纳古菌门(Nanoarchaeota).1.2 μm与 0.1 μm滤膜组合具有最好的CPR和DPANN富集效果,在及时更换滤膜的过滤方式下相对丰度分别提高到 13.33%和 0.58%.[结论]地下水中存在种类丰富但相对丰度较低的CPR和DPANN物种资源,且不同地下水中的 CPR和DPANN存在一定的差异.16S rRNA基因V3-V4 区扩增子测序会遗漏地下水中CPR和DPANN物种信息.在及时更换滤膜的过滤方式下采用不同孔径滤膜组合过滤会显著提高CPR和DPANN的相对丰度,达到富集效果.本研究为后续 CPR和 DPANN 物种资源、基因资源和天然产物资源的挖掘,以及该类菌株的可培养工作奠定了基础.

目的 研究注射用胆固醇基磷酰齐多夫定(5’-cholesteryl-phosphoryl zidovudine,CPZ)自组装体冻干粉规模化制备的处方工艺和性质.方法 采用注入法制备CPZ自组装体,将CPZ的乙醇溶液缓慢注入到水溶液中,并经过旋转蒸发、高压均质处理.通过抑制CPZ分子解离,增加自组装体稳定性,优化处方工艺,涉及不同pH的磷酸盐缓冲液、不同pH的醋酸水溶液、甘露醇,并进一步筛选冻干保护剂用量和灭菌方法.用透射电镜观察CPZ自组装体,用纳米激光粒度仪测定其粒径及Zeta电位.结果 CPZ自组装体冻干粉最优处方工艺为在水溶液中加入甘露醇(甘露醇∶CPZ=2∶1),采用0.05％醋酸水溶液作为水相,可连续制备300 mL以上,并保持稳定.制备的自组装体经0.45.μm无菌滤膜过滤灭菌.CPZ冻干粉加水重新分散后,自组装体的粒径为75.17 nm,PDI值为0.48,Zeta电位为-41.2 mV.透射电镜下显示CPZ自组装体为囊泡结构.结论 本研究优化了规模化制备CPZ自组装体冻干粉的处方工艺,为该新型药物传递系统的成功研制打下基础.

目的:研究不同浓缩方法对丹参提取液的影响.方法:以丹参提取液中丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、总酚酸为指标成分,比较常压蒸发浓缩、减压浓缩、纳滤膜浓缩条件下各指标成分的变化情况.结果:常压浓缩、减压浓缩过程丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、总酚酸含量逐步增加,增幅逐渐减小,常压浓缩含量增幅较减压浓缩大;丹酚酸B含量逐步减小,降幅逐渐减小,常压浓缩含量降幅较减压浓缩大;3种浓缩方法对迷迭香酸均无显著影响.膜浓缩过程对各含量均无显著影响.丹酚酸B降解符合一级反应的特点,常压浓缩降解回归方程为Ln(C)= -0.114 t+2.9476,减压浓缩降解回归方程为Ln(C)= -0.083 t+2.9476.结论:丹参提取液中存在热不稳定性成分,在受热条件下,其酚酸类成分会发生降解与转化,生产过程中应严格控制温度、真空度、时间等参数,以保证批间的一致稳定,使用纳滤膜浓缩方法可最大程度地保持与药液物质基础一致.应采用纳滤膜浓缩方法对丹参提取液进行浓缩.

目的:制备3种不同溶媒介质脂质体,即普通脂质体、乙醇脂质体、丙二醇脂质体,筛选及优化制备工艺,并初步考察其稳定性.方法:以薄膜分散法制备普通脂质体,注入法制备乙醇脂质体和丙二醇脂质体.在相同的处方组成下,考察水化时间、水浴温度、旋转速度等因素对普通脂质体粒径分布的影响,醇水比例、搅拌速度、过膜方式等因素对乙醇脂质体和丙二醇脂质体粒径分布的影响,在此基础上运用正交设计对制备工艺进行优化.以3种不同溶媒介质脂质体的外观形态及平均粒径的变化为指标,分别于第0,1,15,30天取样评价其稳定性.结果:正交试验结果表明,薄膜分散法制备普通脂质体的最佳工艺条件为:水化时间60 min,水浴温度50℃,旋转速度200 r·min-1.注入法制备乙醇脂质体和丙二醇脂质体的最佳工艺条件为:醇水比例1:2,搅拌速度1000 r·min-1,先0.45 μm后0.22 μm微孔滤膜的过膜方式.最佳工艺条件制备得到的3种脂质体均为封闭的单层囊状或多层圆球体,普通脂质体平均粒径(1016.2 ± 135.6) nm,乙醇脂质体平均粒径(578.7 ± 89.2) nm,丙二醇脂质体平均粒径(351.4 ± 53.8)nm.3种脂质体在30 d的观察期内都不稳定,放置15 d后出现明显的分层现象.结论:优化的最佳工艺制得3种不同溶媒介质脂质体粒径均为微纳米级,但稳定性较差,宜临用前配制.

目的 比较不同方法检测胃癌患者腹腔游离癌细胞(intraperitoneal free cancer cells,IFCCs)的阳性率,分析不同时点IFCCs的检测结果与胃癌患者短期预后的关系.方法 连续纳入2014年7月至2016年3月期间于北京大学人民医院胃肠外科接受手术的119例胃癌患者,取开腹后即刻、手术操作完成后即刻、冲洗腹腔后3个时间点,分别以300 ～ 400 ml生理盐水灌洗腹腔并收集灌洗液,进行传统离心法细胞学、滤膜法细胞学、免疫细胞化学以及RT-PCR方法检测IFCCs.采用Kaplan-Meier法绘制胃癌患者生存曲线.结果 3个时点传统细胞学法检测IFCCs的阳性率分别为16.8％、20.7％、11.2％,免疫细胞化学法阳性率分别为28.6％、38.8％、20.7％,RT-PCR法阳性率分别为39.3％、69.5％、50.8％.RT-PCR法检测IFCCs的阳性率高于传统细胞学法和免疫细胞化学法(P＜0.05).开腹后即刻时点,经任一方法检测IFCCs阳性患者的短期预后较阴性患者差(P＜0.05).手术操作完成后即刻时点,仅传统细胞学法检测IFCCs阳性患者的短期预后较阴性患者差(P＜0.05).结论 IFCCs阳性胃癌患者的短期预后较阴性患者差;胃癌根治性手术切除前为检测IFCCs的最佳时机;手术操作可能增加IFCCs的脱落风险,手术操作完成后腹腔冲洗可减少IFCCs.

目的 研制1种以纸为基底材料的免疫传感器,并探讨其在临床检验中的应用价值.方法 本实验选用人IgG为靶抗原,以纳米金修饰的醋酸纤维素滤膜为基底电极,将单克隆鼠抗人IgG抗体固定其表面,利用夹心法结合HRP标记的多克隆兔抗人IgG抗体,方波伏安法检测HRP催化底物所产生的还原电流来检测人IgG含量.结果 该免疫传感器对IgG响应良好,其线性范围为10 ～ 200 ng/ml,相关系数为0.996,检出限为10 ng/ml,并成功应用于检测人血清中IgG.结论 纸基电化学免疫传感器具有检测范围宽、灵敏度高和稳定性好等优点,在临床检验中有广阔的应用前景.