纸基酶联免疫吸附试验(paper-based enzyme-linked immunosorbent assay，p-ELISA)作为新一代纸基微量检测技术，因其检测准确、快速、低成本等诸多显著优点，在临床诊断、食品药品监督等领域已展现出十分广泛的应用前景。文章主要从材料的选择、微孔板的制造和设计、生物分子固定、p-ELISA检测模式及应用等方面进行综述，为进一步实验室研究和实践应用提供依据。

目的 探究肺炎支原体肺炎患儿血清主要组织相容性复合物I链相关基因A(MICA)、骨桥蛋白(OPN)水平及其与反复呼吸道感染的相关性.方法 选取该院2019年3月至2021年3月收治的肺炎支原体肺炎患儿106例作为研究组,另选取同期于该院进行体检的健康儿童106例作为对照组,根据肺炎支原体肺炎患儿是否发生反复呼吸道感染分为反复呼吸道感染发生组和反复呼吸道感染未发生组;使用全自动微生物鉴定系统和纸片扩散试纸进行病原菌检测以及耐药性试验;血清MICA、OPN水平检测采用酶联免疫吸附试验;采用多因素Logistic回归分析影响肺炎支原体肺炎反复呼吸道感染发生的危险因素;绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析血清MICA、OPN单独及联合检测对肺炎支原体肺炎患儿发生反复呼吸道感染的预测价值.结果 106例肺炎支原体肺炎患儿共分离出116株菌株,其中革兰阴性菌77株(66.38％),包括流感嗜血杆菌29株(25.00％),肺炎克雷伯菌17株(14.66％),鲍曼不动杆菌14株(12.07％),铜绿假单胞菌8株(6.90％),阴沟肠杆菌6株(5.17％),其他菌3株(2.59％);革兰阳性菌39株(33.62％),包括金黄色葡萄球菌16株(13.79％),表皮葡萄球菌10株(8.62％),肠球菌6株(5.17％),溶血葡萄球菌5株(4.31％),其他菌2株(1.72％).流感嗜血杆菌耐药率较高的为头孢哌酮,占75.86％,肺炎克雷伯菌耐药率较高的为氨苄西林,占88.24％.16株金黄色葡萄球菌中,对红霉素耐药12株(75.00％),对环丙沙星耐药8株(50.00％),对四环素耐药6株(37.50％),对苯唑西林耐药4株(25.00％),对克林霉素耐药2株(12.50％),未发现对万古霉素和利奈唑胺耐药的金黄色葡萄球菌.研究组血清MICA、OPN水平均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05)o 46例患儿发生反复呼吸道感染,60例患儿未发生反复呼吸道感染.反复呼吸道感染发生组使用药物不当比例,血清MICA、OPN水平均明显高于反复呼吸道感染未发生组,差异均有统计学意义(P＜0.05).多因素Logistic回归分析结果显示,MICA水平升高(95％CI:1.782～3.949)、OPN水平升高(95％CI:1.989～5.012)均为肺炎支原体肺炎发生反复呼吸道感染的危险因素(P＜0.05).ROC曲线分析结果显示,血清MI-CA预测肺炎支原体肺炎反复呼吸道感染的曲线下面积(AUC)为0.899(95％CI:0.836～0.962),截断值为153.702 pg/mL,灵敏度为76.51％,特异度为87.24％.血清OPN预测肺炎支原体肺炎反复呼吸道感染的AUC 为 0.898(95％CI:0.835～0.960),截断值为 101.231 μg/mL,灵敏度为 78.29％,特异度为 84.41％.二者联合检测预测肺炎支原体肺炎反复呼吸道感染的AUC为0.954(95％CI:0.918～0.989),灵敏度为88.35％,特异度为80.24％.二者联合检测预测肺炎支原体肺炎患儿发生反复呼吸道感染的AUC优于血清MICA、OPN各自单独预测的AUC(Z联合vs.MICA=2.624、Z联合vs.OPN=2.735,P＜0.05).结论 肺炎支原体肺炎患儿血清MICA、OPN水平明显升高,二者与反复呼吸道感染密切相关.

本研究旨在建立一种简便、快捷、可直观检测小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)抗体的检测方法.将pET-32a-N重组质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,以纯化的PPRV N蛋白免疫 8周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0 骨髓瘤细胞进行融合,间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)筛选及亚克隆,获得了抗PPRV N蛋白的单克隆抗体.将PPRV N蛋白分别作为金标抗原及检测线(T线)包被抗原、单克隆抗体作为质控线(C线)包被抗体,组装成检测PPRV N蛋白抗体的胶体金免疫层析试纸条.结果显示:成功获得 1 株能稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为 1F1;间接ELISA检测 1F1 腹水效价为 1:128 000;亚类鉴定结果为IgG1,轻链为kappa链.Western blotting结果显示,1F1 能与PPRV N蛋白特异性结合;间接免疫荧光(indirect immunofluorescent assay,IFA)结果显示,制备的单克隆抗体能够识别PPRV;建立的试纸条能够特异性地检测PPRV抗体,以不同批次的试纸条重复检测,结果无差异.根据 122 份临床血清的检测结果,PPRV抗体试纸条与ELISA试验的符合率为 97.6%.本研究建立的试纸条检测方法具有良好的特异性、重复性和敏感性,可用于PPRV抗体的快速检测.

目的 了解痰液中的金黄色葡萄球菌肠毒素分型特点和耐药情况.方法 采用酶联免疫吸附法对164株金黄色葡萄球菌进行肠毒素SEA～SEE基因分型,并采用纸片扩散法(K-B法)进行药敏试验.结果 164株金黄色葡萄球菌检出肠毒素基因140株(85.37％),其中携带1种肠毒素基因型有95株,携带2种肠毒素基因型有34株,携带3种及以上肠毒素基因型有11株.164株中,检出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)89株,检出甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)75株,MRSA对青霉素、苯唑西林、头孢唑林、头孢噻肟、头孢吡肟、红霉素,四环素、庆大霉素的耐药率均>80.00％.结论 金黄色葡萄球菌肠毒素基因检出率较高;MRSA对常用抗生素的耐药率较高,应加强MRSA耐药性监测及规范临床用药.

目的 评价不同检测技术检测河北鼠疫监测工作中腐败材料的应用效果.方法 运用细菌培养、胶体金免疫试纸条(GICA)、反向血凝试验(RIHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)以及聚合酶链式反应(PCR)共5种检测技术对255份鼠脏器材料(肝脾混合物)新鲜时和腐败后分别进行检测,记录实验数据,进行统计分析.结果 细菌培养对新鲜标本检测敏感性为100％,特异性为100％;材料腐败后,鼠疫菌培养检出受限,敏感性仅为16.7％,经卡方检验,有统计学意义.标本腐败对胶体金免疫层析、反相血凝试验、酶联免疫吸附试验和聚合酶链式反应检测结果影响较小,经卡方检验,P值均远远大于0.05,无统计学意义.结论 细菌培养受材料腐败的影响很大,但它是唯一能得到纯菌的方法;抗原检测方法中,胶体金免疫层析技术操作最简单,敏感性和特异性受材料腐败的影响较小,可列为监测中筛选阳性标本的首选方法;聚合酶链式反应是基于分子水平的检测,受材料腐败的影响很小.在实际监测工作中,要联合运用细菌培养,抗原检测和基因检测,以提高鼠疫菌的检出率.

目的 探讨复方脑肽节苷脂对大鼠脑缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用.方法 将120只SD大鼠随机分为假手术组(等体积0.9％氯化钠注射液)、模型组(等体积0.9％氯化钠注射液)、金纳多组(50 mg/kg)与复方脑肽节苷脂低、中、高剂量组(2,4,8 mg/kg),各20只.模型组、金纳多组、复方脑肽节苷脂各剂量组大鼠予缺血再灌注以建立模型,假手术组不阻塞血流.建模成功后各组大鼠腹腔注射相应药物,每天1次,持续14 d.给药7 d及14 d时进行神经运动功能评分;给药14 d后进行贴纸去除及平衡木行走试验,采用逆转录定量聚合酶链反应(PCR)法,酶联免疫吸附(ELISA)法和免疫组化法分别检测大鼠缺血脑组织Beclin1 mRNA,Parkin mRNA,PINK1 mRNA及蛋白表达水平.结果 与假手术组比较,模型组大鼠神经功能缺损评分显著升高,双侧贴纸去除时间、平衡木过杆时间均显著延长,Parkin mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),Beclin1 mRNA,PINK1 mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);与模型组比较,金纳多组及复方脑肽节苷脂低、中、高剂量组神经功能缺损评分均显著降低,双侧贴纸去除时间、平衡木过杆时间均显著缩短,Parkin mRNA和蛋白表达水平均显著降低,Beclin1 mRNA,PINK1 mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05).结论 复方脑肽节苷脂对脑缺血再灌注损伤模型大鼠具有较好的保护作用,能明显改善其神经、感觉及运动功能,其机制与其促进Beclin1 mRNA,PINK1 mRNA及蛋白表达,抑制Parkin表达,从而抑制神经细胞凋亡有关.

目的 建立了一种快速检测人血清中EB病毒衣壳抗原(VCA) IgA抗体的胶体金免疫层析(GICA)方法.方法 预先将EB病毒衣壳抗原(EB-VCA)包被在硝酸纤维素膜上,将鼠抗人IgA抗体免疫金固化在金标垫上.检测时,样本通过层析作用向上流动,样本中的IgA抗体首先被胶体金标记的鼠抗人IgA抗体捕获,其中的EB-VCA IgA抗体再与包被在硝酸纤维素膜上的EB-VCA特异性结合,最后形成包被固相上的EB-VCA与EB-VCA IgA抗体及胶体金标记鼠抗人IgA抗体的三元复合物,通过检测线胶体金沉淀颜色的变化来定性判定样本中是否存在EB-VCA IgA抗体.结果 采用自制的GICA试纸条进行了1028份临床标本的盲法检测,并与酶联免疫吸附试验的EB-VCAIgA抗体诊断试剂盒进行比对,结果表明两种试剂检测的总符合率达到94.56％,阳性符合率为93.40％,阴性符合率为95.17％,Kappa值为0.873,两种诊断试剂具备一致的诊断价值.结论 用于检测血清中的EB-VCA IgA抗体的GICA试纸条的制备条件已基本建立,其检测结果特异性强、稳定性好、操作方法简便快捷且无需特殊仪器设备.

纸基酶联免疫吸附试验(paper-based enzyme-linked immunosorbent assay,p-ELISA)是一种新兴的检测技术,它与传统的96孔板ELISA原理相同,不同的是它以纸作为固相载体.因其试剂用量小、检测快速、成本低、不需特殊仪器等优点在临床受到越来越多的关注.文章主要从载体的选择、纸基微孔的制备、p-ELISA的应用以及本方法的优缺点等方面进行介绍,最后对p-ELISA的应用前景进行展望.

目的:研发基于胶体金的免疫层析试纸,用于龈沟液(GCF)中白细胞介素-1β(IL-1β)水平的即时检测,为牙周炎病变的精确诊断提供实验依据.方法:首先使用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备胶体金,优化反应条件后制备胶体金-抗体复合物,组装胶体金层析试纸后测定其标准曲线,检测临床样本,并与酶联免疫吸附试验(ELISA)检测结果做Spearman相关分析.结果:成功制备了胶体金免疫层析试纸,检测灵敏度可达到5 ng/mL,临床样本检测显示,胶体金试纸与ELISA检测慢性牙周炎组龈沟液IL-1β水平结果的Spearman相关系数为0.992,相关性良好.结论:本研究研发的胶体金免疫层析试纸检测结果具有可靠性,对未来牙周炎患者GCF中IL-1β水平的体外快速检测提供了实验基础.

目的 研制特异性检测嗜肺军团菌(Lp)的胶体金免疫层析试纸条.方法 通过基因工程制备Lp-肽聚糖关联脂蛋白(PAL)重组蛋白并进行纯化,筛选分泌抗Lp-PAL重组蛋白单克隆抗体(简称单抗)的杂交瘤细胞株,采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹法鉴定筛选到的Lp-1和Lp-2单抗的特异性,采用生物膜层干涉(BLI)技术鉴定抗原抗体反应的特异性.依据双抗体夹心原理制备胶体金免疫层析试纸条,并初步评价其检测性能(特异性、灵敏度及稳定性).结果 筛选到2株高效分泌抗Lp-PAL蛋白抗体的杂交瘤细胞株Lp-1和Lp-2,纯化得到2种单抗Lp-1和Lp-2.间接ELISA检测结果表明,Lp-1及Lp-2单抗只与Lp发生阳性反应,与其他10种呼吸道常见病原菌(肺炎链球菌、卡他莫拉菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌)无交叉反应.免疫印迹法结果显示,Lp-1和Lp-2单抗与Lp-PAL天然蛋白和重组蛋白有强反应,与肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌无目的反应条带.BLI技术的验证结果显示,抗原抗体的相互作用力均较强,解离速率慢,Lp-1和Lp-2单抗识别的是同一抗原的不同抗原表位,且只与Lp有强反应,与其他10种细菌均无特异性结合反应.制备的胶体金免疫层析试纸条最低检出限为1×107 CFU/mL,与Lp常见4种血清型(Lp14、Lp12、Lp9和Lp6)均有特异性反应,与肺炎链球菌、卡他莫拉菌等10种常见呼吸道病原菌均无交叉反应,可在25℃环境下稳定6个月.结论 PAL蛋白具有高度的表面暴露性和较强的抗原性,可作为Lp的检测标志物,以此为基础制备的胶体金免疫层析试纸条具有快速、简便、灵敏的特点,适用于Lp感染的快速检测.