目的:构建表达结核分枝杆菌( Mycobacterium tuberculosis， Mtb)潜伏期表达抗原Rv3133c，通过人群以及小鼠实验评价其免疫原性。 方法:构建重组质粒pPROEX-Rv3133c，诱导表达并纯化蛋白质，经Western blot鉴定后，用全血干扰素释放试验评价重组蛋白rRv3133c在 Mtb感染人群中的免疫原性；联合佐剂DC免疫小鼠，检测小鼠血清中rRv3133c特异性抗体分泌水平、脾细胞中抗原特异性Th1型细胞因子分泌水平以及脾细胞中多功能T细胞免疫应答水平和肺脏组织细胞因子mRNA表达水平。 结果:成功构建表达rRv3133c。rRv3133c可刺激 Mtb感染者尤其是潜伏感染者产生高水平的IFN-γ。免疫小鼠后，rRv3133c+DC组小鼠脾脏IFN-γ、TNF-α、IL-2水平，以及IFN-γ +TNF-α +CD4 +T细胞数量和肺脏组织中抗原特异性IFN-γ、TNF-α、iNOS的mRNA表达水平均高于BCG组，但低于BCG+rRv3133c+DC组；rRv3133c+DC组和BCG+rRv3133c+DC组小鼠血清中IgG2a/IgG1比值均大于1，显著高于BCG组。 结论:rRv3133c具有良好的免疫原性，可以诱发机体产生较强的Th1型免疫应答，是结核病亚单位疫苗的潜在候选靶抗原。

目的:甘露糖修饰的脂阿拉伯甘露聚糖(mannose-capped lipoarabinomannan，ManLAM)是结核分枝杆菌细胞壁的主要成分之一，本研究拟探究ManLAM对CE蛋白诱导B细胞抗结核免疫应答的作用及潜在机制。方法:磁珠分选活动性肺结核患者B细胞，ManLAM协同CE蛋白离体刺激，CFSE检测增殖，流式检测B细胞凋亡及活化，ELISA检测细胞因子及抗体亚型分泌水平，酶联斑点试验检测B细胞分化抗体分泌细胞的水平。结果:ManLAM抑制CE蛋白诱导的B细胞增殖、活化、促炎因子释放和分化为CE蛋白特异性IgG分泌细胞，但对凋亡和分化为IgM分泌细胞无显著影响。ManLAM可通过TLR2抑制CE蛋白特异性IgG1和IgG3的分泌，诱导IgG4的分泌。结论:本研究证实ManLAM可抑制B细胞抗结核免疫应答，为结核分枝杆菌免疫逃逸提供了新的理论依据。

目的 基于结核特异性白细胞介素2(IL-2)释放试验的结果,探讨IL-2在辅助诊断活动性结核(ATB)感染中的作用,以及用于监测治疗效果的价值.方法 回顾性分析临床进行了结核感染排查的病例599例,其中确诊为活动性结核感染的病例128例,除外活动性结核感染的病例471例.(1)对与阴性对照共同孵育后上清中IL-2(N)检测值制作ROC工作曲线,分析失去抗原刺激后PBMCs持续释放IL-2的能力;(2)对抗原刺激后的响应值IL-2(T-N),制作ROC工作曲线,分析对活动性结核感染的诊断价值;(3)对比分析两组患者IL-2的阳性率;(4)观察响应值IL-2(T-N)阴性和阳性转化时间与疾病进程的依从性.结果 IL-2(N)ROC曲线下面积为0.460,95％CI 0.402～0.516;IL-2(T-N)ROC曲线下面积为0.788,95％CI 0.745～0.832;在活动性结核感染组,IL-2(T-N)的阳性率显著高于非活动性结核感染组(x2=110.858,P＜0.001);IL-2发生阴阳性转化的平均时间为3.1个月,时间区间为0.5～7个月.结论 PBMCs失去抗原刺激后IL-2仅低水平分泌,对诊断ATB没有价值;结核分枝杆菌特异性抗原刺激后的响应值IL-2(T-N)),用于诊断ATB具有一定准确性;1L-2(T-N)阴阳性转化的时间较短,在监测治疗效果方面存在一定价值,监测时间间隔建议为3个月.

目的 探讨活动性结核病患者外周血结核分枝杆菌抗原特异性多能T淋巴细胞细胞因子的分泌特征.方法 选取2015年11月-2017年3月医院收治的活动性结核病患者、肺部感染/肿瘤患者及同期来健康体检的正常人50例作为对照组.采用γ干扰素释放试验(IGRAS)和流式细胞技术检测CD4+辅助性T细胞1(Th1细胞)和CD8+细胞毒性T细胞(CTL)分泌的肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素(IFN-γ)和白介素-2(IL-2)的分泌情况和分布特征.结果 ESAT-6刺激单个核细胞后,每106个细胞的SFU为84.4±18.1;而CFP-10刺激为54.2±10.8.50例活动性结核病样本中,36例(72.0％)对ESAT-6和CFP-10有反应,14例(28.0％)仅对1种肽有反应.CD4+ Th1细胞和CD8+ CTL分泌的TNF-α、IFN-γ和IL-2三种细胞因子特征类似.活动性结核病组CD4+ Th1细胞分泌TNF-α低于肺部感染/肿瘤组和健康对照组(P＜0.05),而IFN-γ、TNF-α+ IL-2、TNF-α+ IFN-γ+ IL-2均高于肺部感染/肿瘤组和健康对照组(P＜0.05).活动性结核病组CD8+ CTL分泌的TNF-α低于肺部感染/肿瘤组和健康对照组(P＜0.05).IFN-γ、IL-2、TNF-α+ IL-2、TNF-α+ IFN-γ+ IL-2均高于肺部感染/肿瘤组和健康对照组(P＜0.05).结论 活动性结核病患者外周血单个核细胞中结核分枝杆菌抗原特异性多能T淋巴细胞(CD4+ Th1和CD8+ CTL)分泌的IFN-γ+ TNF-α+ IL-2对于鉴别活动性结核病、肺部感染/肿瘤有一定价值.

目的 研究结核杆菌伽马干扰素释放试验(TB-IGRAs)联合NK细胞及炎症因子变化检测在肺结核诊断及预后中的应用价值.方法 回顾性分析2015年12月至2017年12月我院收治的疑似肺结核患者600例,选择同期于我院体检正常的健康对照200例.所有受试者均行TB-IGRAs,并检测NK细胞及炎症因子变化情况,评价各指标单独及联合检测在肺结核诊断和预后中的应用价值.结果 600例患者中肺结核共355例,非肺结核共245例,非肺结核患者主要疾病为肺部感染(165例,67.35％).3组受试者NK细胞、炎症因子水平以及TB-IGRAs阳性率差异显著,其中肺结核组IP-10、MIP-1α、IL-8水平以及TB-IGRAs阳性率显著高于非肺结核组和健康组,而NK细胞水平显著低于非肺结核组和健康组(P＜0.05).TB-IGRAs、NK细胞以及所有细胞因子联合诊断的敏感性、特异性以及准确度均显著高于单项检测(P＜0.05).IL-8、MIP-1α以及联合检测的ROC曲线下面积分别为0.713、0.784、0.898,差异具有统计学意义(P＜0.05).肺结核患者经6个月治疗后,死亡38例(10.70％),其中死亡组患者NK细胞水平显著低于生存组,而IL-2、IL-8、IL-15、IP-10、MIP-1α水平显著高于生存组,联合诊断阳性组患者死亡率(11.24％)显著高于TB-IGRAs阳性组(6.51％),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TB-IGRAs联合NK细胞及炎症因子变化可提高活动性肺结核诊断的灵敏度、准确度,以及有效反应患者预后进展,值得临床推广.

[目的]利用原核表达系统对牛分枝杆菌Mb0950c蛋白进行表达和纯化,通过小鼠模型评价其免疫原性,建立血清学间接ELISA方法用于牛结核病的临床检测.[方法]构建pET32a-Mb0950c原核表达质粒,并转化至BL21(DE3)中诱导蛋白的表达,对蛋白进行纯化.使用流式细胞术(flow cytometry,FCM)、ELISA等对该蛋白在小鼠中的免疫原性进行分析.建立基于Mb0950c的间接ELISA方法,评价该方法的临床检测潜力.[结果]SDS-PAGE和Western blotting结果显示,成功获得了可溶性Mb0950c蛋白,且具有良好免疫反应性;FCM结果显示,Mb0950c蛋白上调了T细胞表面CD69分子的表达.细胞因子和抗体结果表明,该蛋白能够诱导特异性的IFN-y和IL-4的分泌,同时能诱导机体分泌特异性的抗体,且以IgG1型为主.建立了ELISA检测方法应用于牛结核临床检测,结果显示,该方法与牛结核外周血IFN-γ外释放试验和皮试试验结果的阳性符合率、阴性符合率和总符合率分别为65.7％、97.9％和72.4％.[结论]在原核表达系统中可溶性表达Mb0950c蛋白,它在小鼠模型中诱导Th1和Th2型免疫应答,基于此蛋白建立了牛结核病血清学检测的间接ELISA方法.

目的 以结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)H37Rv基因组为模板,构建、纯化及鉴定原核表达质粒pPROEX-Rv3621c,通过人群、小鼠试验进行免疫原性评价.方法 构建重组质粒pPROEX-Rv3621c,并以全血干扰素释放分析技术(Whole-blood IFN-γ release assay,WBIA)检测其能否被安徽省淮南市M.tb感染者T细胞特异性识别.rRv3621c混合佐剂MTM[母牛分枝杆菌(M.vaccae),人工合成海藻糖-6'6,二分枝菌酸(TDB),单磷酰脂质A(MPLA)]免疫小鼠后,检测血清中特异性抗体分泌水平、脾细胞中抗原特异性Th1型细胞因子分泌水平及肺脏细胞因子mRNA表达水平.结果 成功构建重组质粒pPROEX-Rv3621c,并使之诱导表达、纯化和鉴定.在rRv3621c蛋白诱导下,活动性结核(Activetuberculosis,ATB)患者外周血淋巴细胞释放的IFN-γ水平明显较高(t=4.813,P＜0.01),且ATB患者产生的IFN-γ水平高于潜伏性结核(Latent tuberculosis infection,LTBI)人群(t=4.442,P＜0.01).BCG+ Rv3621 c/MTM组小鼠产生的特异性抗体滴度水平明显高于Rv3621c/MTM组(P＜0.01)和BCG组(P＜0.01),Rv3621c/MTM组和BCG+ Rv3621c/MTM组小鼠的IgG2a/IgG1比值大于1,明显高于MTM组和BCG组.BCG+ Rv3621c/MTM组小鼠均分泌高水平IFN-γ、TNF-α和IL-2.Rv3621c/MTM组小鼠肺脏组织中IFN-γ、TNF-α及iNOS表达水平较高.结论 M.tb感染者外周血T细胞可特异性识别rRv3621c蛋白,rRv3621c混合佐剂MTM可以诱导较强烈的抗原特异性Th1型免疫应答.

目的 探讨血清基质金属蛋白酶-9(MMP-9)测定联合肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF检测、γ-干扰素(INF-γ)释放试验对肺结核的诊断效能.方法 选取2019年5月—2020年5月河北省胸科医院200例疑似肺结核患者,根据检查结果分为菌阳肺结核组(62例)、菌阴肺结核组(88例)、非肺结核组(50例),比较3组血清MMP-9、白细胞介素(IL)-15、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)和INF-γ释放试验、结核分枝杆菌(MTB)培养、肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF检测结果的差异,多因素分析采用Logistic回归分析,采用受试者工作特征(ROC)曲线评价血清MMP-9测定、肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF检测、INF-γ释放试验单独和联合诊断肺结核的效能.结果 菌阳肺结核组、菌阴肺结核组及非肺结核组MMP-9、INF-γ水平差异均有统计学意义(P<0.05),其他指标差异均无统计学意义(P>0.05).肺结核患者MMP-9、INF-γ水平均高于非肺结核患者(P<0.05).菌阳肺结核组Xpert MTB/RIF阳性率明显高于菌阴肺结核组(P<0.05),2个组之间INF-γ释放试验阳性率及INF-γ水平差异均无统计学意义(P>0.05).Logistic回归分析结果显示,MMP-9[比值比(OR)值为1.687,P=0.004]、INF-γ(OR=2.511,P=0.005)和Xpert MTB/RIF(OR=1.340,P=0.005)是肺结核的危险因素.Xpert MTB/RIF检测诊断肺结核的敏感性为86.7％,特异性为96.0％,准确性为89.0％;INF-γ释放试验诊断肺结核的敏感性为80.0％,特异性为62.0％,准确性为75.5％;MMP-9诊断肺结核的敏感性为80.7％,特异性为60.0％,准确性为75.0％;3种方法联合诊断肺结核的敏感性为90.7％,特异性为78.0％,准确性为87.5％.结论 MMP-9和INF-γ高表达、Xpert MTB/RIF阳性是肺结核的危险因素,3种方法联合诊断肺结核的敏感性和特异性明显增强,具有一定的临床意义.

目的 探讨γ-干扰素释放试验(IGRA)联合FadD9重组蛋白对重症肺结核患者的诊断及死亡预后的预测价值.方法 选取2018年1月～2021年2月我院收治的127例重症肺结核患者(重症肺结核组),74例非重症肺结核患者(非重症肺结核组),选取同期与结核病患者有1年以上密切接触史的患者36例(密接组)及我院体检健康者92例(对照组).从美国国立生物技术信息中心网站上获取fadD9基因序列(基因ID:888574),制备和鉴定FadD9重组蛋白,评估其免疫原性、特异性抗体水平及其临床血浆样本中的细胞免疫水平.记录并统计重症肺结核患者预后,并依据预后死亡情况分为存活组(93例)和死亡组(34例);比较存活组和死亡组患者的一般临床资料.采用Cox比例风险回归筛选出影响重症肺结核患者死亡的危险因素,纳入并建立Nomogram预测模型,计算一致性指数(C-index).分别使用ROC、校准曲线、临床决策曲线对Nomogram预测模型进行区分度、校准度和临床有效性进行评价.结果 与阳性参照抗原Ag85A蛋白相比,FadD9重组蛋白的A值变化与其基本一致,且均高于阴性对照组.FadD9重组蛋白的血清抗体滴度达1:12800.FadD9免疫组IL-2、TNF-α和IFN-γ水平分别为126.95、225.87、395.92 pg/mL,三者比例为1.00:1.78:3.12.重症肺结核组抗FadD9抗体水平明显高于对照组和密接组,差异有统计学意义(P<0.001).BMI、APACHEⅡ、呼吸衰竭、COPD、肺心病、器官损害、肺部感染、多重耐药结核菌、低血清白蛋白浓度、IGRA、FadD9重组蛋白抗体水平均是重症肺结核患者死亡的危险因素(P<0.05).构建的Nomogram模型的C-index为0.742(95％CI:0.684～0.845).Nomogram模型的曲线下面积为0.802(95％CI:0.764～0.840),灵敏度、特异度及约登指数分别为85.42％、74.05％和0.595,具有较高的预测效能.整体上看Nomogram模型预测重症肺结核患者死亡的准确度和有效性均较好.FadD9重组蛋白诊断重症肺结核的曲线下面积为0.748,最佳临界值为0.352,敏感性为97.33％,特异性为72.51％.结论 IGRA可有效诊断重症肺结核,FadD9重组蛋白可作为IGRA新型抗原组合的候选成分,用于诊断重症肺结核的敏感性较高.本研究构建的Nomogram模型在一定程度上可作为临床重症肺结核患者死亡预后辅助预测工具.

目的:研究可替代的细胞因子联合结核分枝杆菌休眠相关抗原Rv1733用于肺结核的血清学诊断价值.方法:对来自广东医科大学附属龙华中心医院的结核病患者(结核病组,n=25)和无症状接触者(ACs组,n=25)的外周血单个核细胞(PBMCs)用结核分枝杆菌γ干扰素释放试验(IGRAs)和休眠相关抗原(Rv1733)进行6 d体外再刺激后,在培养上清液中进行多重细胞因子分析.结果:经IGRAs抗原特异性再刺激后结核病组白细胞介素-2(IL-2)水平高于ACs组(P=0.032).结核病组和ACs组PBMCs上清液中γ干扰素诱导蛋白-10(IP-10)、IL-2、IL-6水平与黄金标准γ干扰素(IFN-γ)呈正相关关系(P＜0.05).结核病组IL-2水平与IFN-γ水平无显著相关关系(r=0.305,P=0.105).采用调整后的IGRAs标准,IL-6检测到结核病组患者(n=23,92.0％)和ACs组患者(n=22,88.0％)的应答比例最高.Rv1733再刺激可提高ACs组中IFN-y、IP-10、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-17F浓度,而结核病组和ACs组IL-2、IL-22和IL-5水平差异无统计学意义(P＞0.05).经ROC曲线分析,Rv1733诱导的IFN-γ与IGRAs抗原诱导的IL-2组合是对结核患者和ACs分类的最佳选择(AUC:0.928;95％CI:0.883～0.971).结论:可替代细胞因子联合结核分枝杆菌休眠相关抗原Rv1733可提高对结核分枝杆菌感染的诊断能力.