目的 探索斑马鱼叶酸多聚谷氨酸合成酶(FPGS)的生物信息学特征及在胚胎发育中的表达模式.方法 利用Ensemble数据库及ClustalW程序进行序列比对,分析斑马鱼与哺乳动物FPGS蛋白之间的氨基酸同源性;利用系统发育树分析不同物种间fpgs基因的保守性;运用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析fpgs基因在斑马鱼重要器官及胚胎早期发育中的表达;运用整胚原位杂交技术检测野生型斑马鱼fpgs mRNA的表达.结果 生物信息学分析显示,斑马鱼FPGS蛋白在进化上与哺乳动物同源物高度保守.RT-PCR结果显示,斑马鱼fpgs基因不仅在胚胎的各个发育阶段均有表达,且在成鱼的脑、肝和胃组织中高表达.原位杂交结果显示,fpgs基因在斑马鱼胚胎4细胞期广泛表达,而在尾芽期开始仅在卵黄合体细胞层中表达;在斑马鱼胚胎20体节期,fpgs在产生初级造血祖细胞的中间细胞团、眼睛和后脑区域呈现特异性表达;从斑马鱼胚胎受精后48～96 h,fpgs基因在其肝脏及端脑与后脑的交界处特异性表达.结论 斑马鱼的FPGS蛋白与哺乳动物同源物高度保守,且fpgs基因在斑马鱼发育中的初级造血区、肝脏、后脑区及眼睛特异性表达,提示该基因在这些组织的发育中可能发挥着重要作用.

肝移植的巨大需求与可用供肝数量不匹配是长期存在的矛盾,急性或慢性肝功能衰竭的患者各种替代治疗不断派生.对于细胞生物学及肝脏修复过程的研究进展,使得干细胞成为再生医学中治疗肝脏疾病的新热点.目前研究中,肝再生的细胞来源已经囊括多种类型细胞,如成人肝干细胞和胎肝干细胞、肝内干细胞群、成人骨髓来源的造血干细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞和诱导多能干细胞.这些高度不同的细胞,可以作为细胞悬液使用,或者与生物材料组合形成可植入的肝组织构建体,为肝再生的研究带来了新的希望.然而,在干细胞全面广泛地应用于临床前,细胞治疗肝脏疾病仍有很多关键障碍需要克服.本文总结了以干细胞为基础治疗肝脏疾病领域的最新技术,以及现有的挑战,提出了将来研究的新方向.

干细胞在临床上的使用是安全的,也就是说,其具有随时增生和/或扩大,不形成肿瘤的特点.尽管胚胎干细胞(ESCs)具有多能性,可以用来取代任何组织,能形成畸胎瘤.研究干细胞移植的造血干细胞(HSC)可来自不同来源(骨髓、血液和脐血).肝星状细胞随后也被用于细胞治疗.其他成年干细胞数量正在评估临床细胞和多能的成年祖细胞中的作用[1-3].

胚胎来源巨噬细胞(embryonicstem cell-derived macrophages,EDMs)是一种来源于胚胎祖细胞的巨噬细胞亚群,在胚胎时期就进入特定的组织.在正常肝脏中,EDMs通过自我更新维持数量,在稳态期间很少需要骨髓单核细胞分化补充.肝脏发生炎症反应时,肝组织中的EDMs由M1型转为M2型,并募集骨髓单核细胞,平衡Ⅰ型与Ⅱ型炎症反应,进而发挥免疫监视、损伤修复、维持稳态的功能,有效避免肝脏慢性炎症的发生和恶变.其位于肝血窦内,具有吞噬循环肿瘤细胞的功能.而在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的后期发展阶段,EDMs和骨髓来源单核细胞系相互作用,参与构成肿瘤免疫抑制的微环境.本文就巨噬细胞的起源及EDMs在肝脏中维持稳态、介导炎症等方面的作用作一综述.

为了利用透明质酸建立小鼠胎肝细胞3D培养体系,分离获得胚胎12～14d胎肝细胞,利用KM培养基进行初步2D肝干/祖细胞的筛选培养,并利用透明质酸及KM培养基配制水凝胶建立3D细胞培养体系.胎肝细胞在2D体系中呈现克隆状生长.分离培养获得的肝干/祖细胞,克隆在透明质酸建立的3D培养体系保持增殖活性,并进一步获得肝细胞功能特性,表现为3D培养上清中白蛋白合成和尿素水平显著增加.定量PCR结果显示,随着3D培养时间的延长,其肝细胞干性标志如AFP、CK19、EpCAM、Prox1等表达水平都大幅度降低且接近成年小鼠肝脏表达水平.本研究成功建立基于透明质酸的小鼠胎肝细胞的3D无血清培养体系,并可促进小鼠胎肝细胞的肝细胞功能进一步成熟.

该研究探讨全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)体外诱导小鼠胚胎肝祖细胞HP14-19细胞成熟分化及ATRA对细胞自噬水平的调控作用.应用1 μmol/L ATRA处理小鼠胚胎肝祖细胞HP14-19细胞,不同时间点进行荧光素酶报告基因检测ALB-Gluc活性,Real-time PCR检测肝细胞相关标志基因的表达,吲哚菁绿(indocyanine green,ICG)及过碘酸–希夫(periodicacid-schiff,PAS)染色检测细胞的成熟功能;透射电镜观察自噬体及细胞连接,ptfLC3质粒转染细胞,激光共聚焦显微镜观察自噬流,Western blot检测自噬相关标志蛋白质水平等综合分析自噬的变化情况.结果显示,与对照组相比,ATRA可显著增强HP14-19细胞ALB-Gluc活性,抑制肝前体细胞标志DLK和AFP的表达,促进成熟肝细胞标志ALB、CK18、TAT和ApoB的表达,ICG及PAS染色阳性细胞数显著增多(P<0.05);透射电镜结果可见ATRA诱导组出现大量自噬体和自噬溶酶体,同时细胞间紧密连接增多,并且自噬相关标志蛋白质Beclin1、LC3-II、RAB7水平增高,P62水平无显著变化,LC3-II/LC3-I的比值明显增加(P<0.05);激光共聚焦显微镜可见ATRA组细胞质内黄色斑点的自噬体及红色斑点的自噬溶酶体均较对照组明显增多,自噬抑制剂3-MA和Baflomycin可抑制ATRA诱导的HP14-19细胞的ICG摄取和糖原合成功能.综上所述,ATRA可能通过调节细胞自噬水平有效诱导小鼠胚胎肝祖细胞的分化成熟.

为了探讨不同血清浓度诱导培养条件下对体外诱导胚胎肝祖细胞成熟分化的影响.本研究选用含有10％ FBS、5％ FBS、2％ FBS的DMEM/HGF/FGF4肝细胞培养基体外诱导胚胎肝祖细胞的成熟分化,分别于诱导后0d、3d、6d、9d、12 d ALB-GLuc检测细胞白蛋白的合成水平,细胞计数检测细胞的成长曲线.RT-PCR检测肝细胞相关标志DLK、AFP、CK18,免疫荧光检测ALB、UGT1A的表达情况.ICG摄取和尿素氮检测肝细胞成熟功能.诱导后第三天,ALB-GLuc开始增高,于第9天达高峰,2％ FBS组ALB-GLuc读数最高.生长曲线显示低血清浓度下细胞的增殖速度明显慢于高血清浓度.RT-PCR和免疫荧光结果显示诱导后第9天,3个诱导组DLK、AFP表达低于无诱导组,CK18、ALB、UGT1A均高于无诱导组,2％ FBS组差异最显著.3个诱导组的肝细胞ICG摄取能力明显增高,2％FBS组ICG阳性细胞数为(60.2±9.0)％,明显高于5％ FBS (45.0±3.6)％及10％ FBS组(35.2±2.9)％,诱导后肝细胞的尿素合成功能增强,尤其是2％ FBS组.低浓度血清培养条件能更好的诱导胚胎肝祖细胞的体外成熟分化.

Asahara等[1]于1997年成功的从人外周血中分离出内皮祖细胞(EPC),自此揭开了EPC血管再生功能研究的序幕.EPC起源于骨髓,可以被外伤、缺血和肿瘤发生时分泌的生长因子和细胞因子动员到外周血中.除了骨髓和外周血,脐带血、胎肝和骨骼肌中也成功地分离出EPC.EPC主要参与胚胎发育时期的血管生成,研究发现,EPC也参与出生后的血管再生,即血管发生和血管生成,前者是指EPC参与生成整条新生血管,后者则是在已有的血管基础上芽生出新的血管.EPC数目非常少,在成人外周血中更加稀少,只占总细胞0.01％,可能与成熟内皮细胞更新率低有关.笔者就EPC的研究进展和在肿瘤疾病的潜在应用如下综述.

目的 探讨人胚胎发育过程中间充质干祖细胞(MSPCs)与造血细胞间的起源关系.方法 取发育不同时间药流胚胎,分离不同造血组织消化成单个细胞,于高增殖潜能集落形成细胞(HPP-CFC)培养体系培养10～14 d,倒置显微镜下挑取直径大于0.5 mm的HPP-CFC集落于液体培养体系进行二次培养,对二次培养中出现的贴壁细胞进行扩增并鉴定其细胞表面分子的表达,于不同分化体系鉴定其是否具有MSPCs的分化特性.结果 本研究总结了胚胎发育不同时期主动脉-性腺-中肾(AGM)区、卵黄囊、胎肝等不同部位包括HPP-CFC在内的各类造血前体细胞的发育动态,发现从28体节开始,一定比例的AGM区HPP-CFC除能够分化产生造血细胞外,其来源的贴壁细胞具有MSPCs的分化功能,贴壁细胞在淋巴母细胞转化实验中可抑制T细胞的增殖.结论 人胚胎AGM区内,部分MSPCs和造血细胞起源于共同前体.

目的 探讨不同Wnt蛋白对小鼠胚胎肝祖细胞HP14-19分化的作用,筛选有效的肝干细胞定向分化体系,为治疗肝衰竭提供理论基础.方法 携带不同Wnt蛋白基因的19种重组腺病毒,分别感染HP14-19,检测清蛋白启动子启动的荧光素酶报告基因活性;实时荧光定量PCR检测detla蛋白DLK、甲胎蛋白(AFP)、清蛋白(ALB)、上皮特异性标志物细胞角蛋白(CK18)等肝细胞分化成熟相关标志物的表达情况;糖原(PAS)染色实验和吲哚菁绿(ICG)摄取实验用于检测肝细胞合成代谢功能.结果 19种Wnt腺病毒均能有效感染HP14-19细胞并表达相应的Wnt信号蛋白,随着处理时间的延长,荧光素酶值逐渐升高,其中Wnt3a的作用最明显;Ad-Wnt3a组肝干细胞标志DLK、AFP表达明显下降;肝细胞特异性成熟标志ALB、CK18明显上调;Ad-Wnt3a处理后PAS染色可见70％～80％的细胞染色阳性,细胞由多角形变为长梭形;ICG摄取实验可见大量绿色圆形或者多边形阳性细胞.结论 Wnt3a蛋白是诱导HP14-19细胞成熟分化的重要蛋白,诱导分化后的细胞类似于成熟肝细胞,有较强的合成代谢功能;对进一步研究肝干细胞分化调控及肝移植应用有重要意义.