[目的]在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中建立一套分子靶向突变系统,为毕赤酵母的基因工程改造提供高效的编辑工具.[方法]基于规律成簇的间隔短回文重复序列/Cas9核酸酶(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 nuclease,CRISPR/Cas9)技术,设计并构建nCas9与胞苷脱氨酶融合表达的胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor,CBE),并选择酵母基因组中富含碱基C的一段序列作为靶标以评价CBE的碱基编辑功能.电转化酵母后,利用高通量测序技术分析CBE的编辑效率及编辑模式,并进一步探究连接肽长度、融合蛋白相对位置和gRNA靶向序列(即spacer)长度等因素对CBE功能的影响.[结果]nCas9与PmCDA1融合组成的CBE能够实现毕赤酵母基因组碱基C的高效编辑.当连接肽长度为(GGGGS)1o时,CBE的编辑效率最高,编辑窗口位于前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)远端的C20-C14之间,其中C18的编辑效率可达85.1％.nCas9与PmCDA 1相对位置的改变对CBE的编辑效率和编辑模式的影响不大.而gRNA靶向序列长度影响着CBE的编辑效率,且gRNA靶向序列长度不能低于17 nt,但19-23 nt之间均可引导CBE对基因组的高效编辑.[结论]本研究在巴斯德毕赤酵母中构建了 一套具有高效碱基编辑活性的胞嘧啶碱基编辑器,为基于毕赤酵母的基础和应用研究提供了工具支持.

碱基编辑技术起源于CRISPR/Cas系统,是目前最新的基因定点修饰技术.根据碱基编辑器的功能特点,可将碱基编辑器分为胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor,CBE)、腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor,ABE)、糖基化酶碱基编辑器(glycosylase base editor,GBE)、腺嘌呤碱基颠换编辑器(adenine transversion base editor,AYBE)、双碱基编辑器(dual base editor,DBE)和引导编辑器(prime editor,PE).自碱基编辑系统诞生以来,已经广泛运用于动植物的研究中,并且已经证明了它在动植物遗传改良和疾病治疗中具有巨大应用价值.猪作为一种重要的农业经济动物和优良的动物疾病模型,对其进行遗传改良则变得十分重要.碱基编辑技术因其操作便利、高效、副产物少以及性价比高等特点,被迅速应用于动植物的遗传改良,并为人类的基因治疗提供技术支持.本文着重介绍了碱基编辑技术的开发、优化、应用特点、存在的问题以及对未来的展望,并总结了其在猪中的应用.以期为相关科研工作者了解碱基编辑技术提供参考.

线粒体作为真核高等生物的能量工厂,通过有氧呼吸的方式为各项生命活动提供能量(ATP).线粒体拥有一套独立于细胞核的基因组——线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA),编码 37 个基因,其突变会导致线粒体疾病,目前已在人mtDNA中鉴定出了超过 100 种致病突变位点,总发病率约为 1/5000.近年来,基于CRISPR的碱基编辑技术已经实现了对核基因组的精确编辑,然而由于CRISPR系统中的引导RNA难以通过线粒体的双层膜结构,在mtDNA上实现精确的碱基编辑仍具有较大的挑战性.2020 年,美国哈佛大学David R.Liu 实验室报道了一种伯克霍尔德氏菌来源的双链 DNA 脱氨酶 DddA,将其与可编程的转录激活样效应因子(transcription activator-like effector,TALE)和尿嘧啶糖苷酶抑制剂(uracil glycosylase inhibitor,UGI)融合组装成为DdCBEs(DddA来源的胞嘧啶碱基编辑器),首次在mtDNA上实现了特异高效的C·G到T·A的转换.本文对近几年基于DddA的线粒体碱基编辑技术的发展进行综述,并对其未来应用前景进行展望,以期为相关领域的科研人员进一步了解、使用及优化线粒体碱基编辑技术提供参考.

碱基编辑器是近两年发展起来的新型基因组编辑工具,它将碱基脱氨酶的催化活性和CRISPR/Cas系统的靶向特异性进行结合,催化DNA或RNA链上特定位点的碱基发生脱氨基反应,进而完成碱基的替换.碱基编辑器分为DNA和RNA碱基编辑器两大类,其中DNA碱基编辑器分为两种:胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器;前者可以实现胞嘧啶到胸腺嘧啶的转换,而后者则可以将腺嘌呤突变为鸟嘌呤.由于DNA碱基编辑器不会造成DNA的双链断裂(DSB),也不依赖于宿主的非同源末端修复和同源重组途径,因此,大大减少了DSB相关的编辑副产物,如小片段插入或缺失等.基于CRISPR/Cas系统的RNA碱基编辑器,可以实现RNA链上腺嘌呤核苷到次黄苷的转换.本文对不同类型碱基编辑器的开发过程、适用范围和编辑特点等进行梳理,并对其在细菌基因组编辑中的应用进行了介绍;最后简要探讨了细菌中碱基编辑器的缺点以及将来可能的研究方向.

碱基编辑技术,以CRISPR/Cas系统为平台,引导胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶至特定的基因组靶点,产生靶向性的C至T或者A至G的碱基转换.自碱基编辑技术问世以来,全球多个科研团队通过优化改进得到了一系列高精准性、广靶向性、小编辑框、普适性的碱基编辑器.在应用方面,碱基编辑器能够在人体细胞、动植物细胞以及胚胎中进行高效的碱基转换,在治疗人类遗传病、构建动物疾病模型、植物育种等方面具有巨大的应用潜能.本文就碱基编辑技术的发展、优化和应用等方面进行综述和展望.

基于CRISPR-Cas的单碱基编辑工具是近2年基因组编辑技术的重大突破之一,已经在人类(Homo sapiens)细胞和动植物中得到了验证与应用.最近,中国科学家分析了胞嘧啶编辑器(CBE) BE3和HF1-BE3,以及腺嘌呤编辑器(ABE)等单碱基编辑工具在水稻(Oryza sativa)中的脱靶现象,发现BE3和HF1-BE3两个CBE在全基因组范围内存在脱靶编辑,而ABE则没有脱靶现象.这一发现对单碱基编辑工具的应用和进一步改进具有重要意义.

碱基编辑技术(base editing)是基于CRISPR/Cas系统发展起来的新型靶基因修饰技术,目前依据碱基修饰酶的不同可分为胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor,CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor,ABE).这两类碱基编辑系统利用胞嘧啶脱氨酶或人工进化的腺嘌呤脱氨酶对靶位点进行精准的碱基编辑,最终可以分别实现C-T(G-A)或A-G(T-C)的碱基替换.碱基编辑技术自2016年被开发以来,因其高效、不依赖DNA双链断裂产生、无需供体DNA参与等优势,已经成功应用在各种动物、植物及其他生物中,为基因治疗及精准作物育种等领域提供了重要技术支撑.本文从碱基编辑技术的特点、开发过程、优化、应用、脱靶效应及改善策略等方面进行了系统介绍,最后对未来需要迫切解决的一些问题进行了分析和展望,以期为相关领域的科研人员进一步了解、使用及优化碱基编辑系统提供参考.

碱基编辑技术结合了CRISPR/Cas系统的靶向特异性与碱基脱氨酶的催化活性,因其不产生双链DNA断裂、不需要外源DNA模板、不依赖同源重组修复,自开发以来,便受到研究者的追捧,在哺乳动物细胞、植物、微生物等领域相继得到开发与应用.为了进一步丰富碱基编辑系统在谷氨酸棒杆菌中的应用,将鼠源胞嘧啶脱氨酶(rAPOBEC1)与nCas9蛋白融合,实现了在谷氨酸棒杆菌中C到T的编辑,编辑比例较低(0-20％);在上述融合蛋白C端添加UGI蛋白,构建BE3型胞嘧啶碱基编辑器,抑制体内的DNA碱基切除修复机制,显著的提高了碱基编辑效率,使得C到T的碱基编辑效率高达90％;为了简化操作,将双质粒碱基编辑系统优化为单质粒碱基编辑系统,并显著提高转化效率;最后通过单质粒碱基编辑系统对基因组中其他位点的编辑测试,进一步证明了BE3型碱基编辑器在谷氨酸棒杆菌中的高效性,同时发现该碱基编辑器具有较宽的编辑窗口(PAM上游-11到-19位),有助于覆盖更多的基因组靶标位点,为谷氨酸棒杆菌的基因组改造提供了更多的工具选择.

华东师范大学生命科学学院上海市调控生物学重点实验室李大力研究团队在双碱基基因编辑工具的研发与应用领域取得重要进展.该研究通过对CBEs(C→T)及ABE7.10(A→G)主要功能元件的空间位置及其对应的碱基编辑性能进行详细的筛选与对比,最终确认了TadA-TadA*元件整合在D10A(nickase Cas9)的N端时双碱基基因编辑工具有最好的活性,开发了hAID-TadA-TadA*-nCas9-UGI-UGI的碱基基因编辑工具:A&C-BEmax,并通过类红细胞细胞系HUDEP-2细胞模型证明这一工具在临床治疗中的潜力.相关研究工作以“Dual base editor catalyzes both cytosine and adenine base conversions in human cells”(双碱基编辑器催化人细胞中胞嘧啶和腺嘌呤的转化)为题于2020年6月1日在线发表于Nature Biotechnology[1].

在众多生物中利用具有切割作用的CRISPR/Cas9系统与非同源性末端连接(non-homolo-gous end joining,NHEJ)修复系统或同源性末端连接(homology-directed repair,HDR)修复系统共同完成基因编辑工作都有报道.但是由于NHEJ的不精确性以及一些微生物中HDR效率较低导致生物体死亡限制了该工具的发展.基于CRISPR/dCas9系统构建而成的DNA碱基编辑器作为一种编辑工具,可靶向地实现碱基之间的转换,且不导致微生物死亡.DNA碱基编辑器在微生物中已经实现靶向编辑工作,可以同时多个位点进行编辑,同时可以利用该工具将编码氨基酸的密码子转化为终止密码子,提前终止翻译过程实现对基因的失活.本文主要对DNA碱基编辑器的作用原理,发展历程以及在微生物中的应用做了概述,最后提出了该工具存在的一些不足之处,并结合相关研究展望了未来的研究方向.为在微生物中开发与利用DNA碱基编辑的研究提供了思路.