利用异源重组表达系统表达外源蛋白是基因工程研究的重点.巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种甲基营养型酵母,由于其易于遗传操作、高水平分泌外源蛋白、翻译后修饰等特点,已成为工业应用中蛋白质生产的重要菌株,常被用于酶制剂的生产.然而,部分外源蛋白在毕赤酵母系统中的表达水平较低,仍有待提升的空间.因此,进一步探索提升毕赤酵母中外源蛋白表达量的原理和方法,将对降低毕赤酵母表达系统工业化生产成本,提高经济效益,具有重要的意义.本文主要从基因水平、转录水平、翻译水平、折叠分泌水平、抗逆水平、发酵工艺六个方面归纳总结了近年来毕赤酵母提高外源蛋白表达的优化策略的研究进展,旨在为提高外源蛋白在毕赤酵母表达系统中的表达水平提供有益参考.

[目的]在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中建立一套分子靶向突变系统,为毕赤酵母的基因工程改造提供高效的编辑工具.[方法]基于规律成簇的间隔短回文重复序列/Cas9核酸酶(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 nuclease,CRISPR/Cas9)技术,设计并构建nCas9与胞苷脱氨酶融合表达的胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor,CBE),并选择酵母基因组中富含碱基C的一段序列作为靶标以评价CBE的碱基编辑功能.电转化酵母后,利用高通量测序技术分析CBE的编辑效率及编辑模式,并进一步探究连接肽长度、融合蛋白相对位置和gRNA靶向序列(即spacer)长度等因素对CBE功能的影响.[结果]nCas9与PmCDA1融合组成的CBE能够实现毕赤酵母基因组碱基C的高效编辑.当连接肽长度为(GGGGS)1o时,CBE的编辑效率最高,编辑窗口位于前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)远端的C20-C14之间,其中C18的编辑效率可达85.1％.nCas9与PmCDA 1相对位置的改变对CBE的编辑效率和编辑模式的影响不大.而gRNA靶向序列长度影响着CBE的编辑效率,且gRNA靶向序列长度不能低于17 nt,但19-23 nt之间均可引导CBE对基因组的高效编辑.[结论]本研究在巴斯德毕赤酵母中构建了 一套具有高效碱基编辑活性的胞嘧啶碱基编辑器,为基于毕赤酵母的基础和应用研究提供了工具支持.

以解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)为代表的非常规酵母凭借较广的底物利用谱、较强的环境耐受性等优势,已成功实现多种天然产物的高效生产.随着合成生物学及基因编辑技术的发展,针对非常规酵母代谢工程改造的工具和策略也逐渐丰富.本文介绍了几类常见的非常规酵母的生理特性、工具开发及应用现状,并总结归纳了天然产物合成优化中常用的代谢工程策略;最后讨论了现阶段非常规酵母作为天然产物合成细胞工厂的优势和不足,并对后续研究和发展趋势进行了展望.

[目的]基于转录组学技术研究表达磷脂酶A2的毕赤酵母重组菌在甲醇诱导表达外源蛋白时的基因表达差异,从而解析外源蛋白高效诱导表达机制,为进一步工程菌株的改造提供理论支撑.[方法]以一株产磷脂酶(PLA2)的毕赤酵母为出发菌株,采用RNA-Seq二代测序方法,研究在甘油培养和甲醇诱导两种条件下,重组毕赤酵母转录组基因表达差异情况.[结果]重组毕赤酵母中共鉴定到5225个转录本.甘油培养与甲醇诱导相比,共有857个基因发生显著变化.依据代谢途径分类,差异基因集中在核糖体成分、甲醇代谢、磷酸戊糖途径、糖酵解途径、柠檬酸循环、乙醛酸循环以及蛋白质加工过程.[结论]通过分析甲醇诱导前后的差异表达基因,结果表明碳源改变对胞内代谢会产生全局影响.本研究结果为进一步研究毕赤酵母表达外源蛋白的机制提供了基础.

目的 构建重组人肝细胞生长因子(rhHGF)的真核表达载体,为后续毕赤酵母蛋白高效表达提供基础.方法 根据酵母表达偏爱密码子合成rhHGF cDNA全长序列,将rhHGF和pGAPZαA质粒双酶切后行连接转化,构建穿梭载体pGAPZαA-rhHGF,并鉴定.结果 重组真核表达载体pGAPZA-rhHGF经限制性内切酶分析,与理论值相符,测序结果未见碱基变异.结论 成功构建了pGAPZαA-rhHGF真核表达载体,为后续毕赤酵母高效表达rhHGF蛋白提供了可行性.

目的:获得表达量较高且有活性的人源SIRT4蛋白.方法:将SIRT4基因克隆到pPICZA载体上,得到重组pPICZA-SIRT4表达质粒.重组质粒线性化后转入到巴斯德毕赤酵母X33感受态细胞中,筛选出阳性菌株.将阳性重组菌株发酵培养,并对诱导剂甲醇浓度进行优化,表达蛋白用镍柱HisTrapTM HP进行纯化,并对表达的蛋白进行活性考察.结果:SDS-PAGE显示表达的SIRT4目的蛋白大小约33000,与预期蛋白相对分子质量大小相符,进一步利用His标签抗体通过Western blot确认了目标蛋白,并且初步验证了SIRT4的去生物素酰化和去硫辛酰化的活性.结论:成功用巴斯德毕赤酵母表达了有活性的SIRT4蛋白,并且获得酵母表达的最佳诱导条件.

巴斯德毕赤酵母是用途广泛的蛋白表达系统.目前用于毕赤酵母的质粒主要以整合型质粒为主,很少见到游离的质粒用于外源基因的表达.文中通过将来源于酵母自身的自主复制序列连接到酵母整合型表达载体pGAP中构成自主复制的游离型表达载体pGAPZαA-PARS,将该载体用于表达木聚糖酶基因.转化毕赤酵母后同传统的整合型表达菌株相比,以甘油为碳源时最高酶活达到343 U/mL,比整合型表达提高了45.9％.同时游离载体表达重组酶比活相对整合表达提高了81.2％.为了节约发酵成本,进一步研究了分别以甘油、葡萄糖、蔗糖、混合碳源(蔗糖∶甘油=1∶2)等不同碳源下游离型重组菌株的表达水平.发现甘油表达水平最高,蔗糖最低,但是以工业葡萄糖为碳源时产酶成本最低.由于pGAP载体不需要以甲醇为碳源,因而文中所构建的游离载体pGAPZαA-PARS极大促进了毕赤酵母在食品行业中的应用.同时,游离型载体可大幅度提高表达水平,为进一步研究提高GAP启动子的高效表达奠定了基础.

探讨重组巴斯德毕赤酵母发酵生产内切几丁质酶的最适培养条件,以期获得最佳的内切几丁质酶活力.以内切几丁质酶活力为指标,通过部分因子试验设计以及响应面法优化确定重组巴斯德毕赤酵母高产内切几丁质酶的最适培养条件.部分因子试验设计筛选的影响重组巴斯德毕赤酵母高产内切几丁质酶的3个关键因子为甲醇、油酸和吐温-80.响应面法优化的上述3个关键因子的最佳浓度分别为0.71％、0.086％和0.31％.重组巴斯德毕赤酵母发酵生产内切几丁质酶的最适培养条件为:酵母膏1％、酵母氮碱(YNB) 1.34％、蛋白胨2％、甲醇0.71％、油酸0.086％、吐温-80 0.31％、PTM1 0.8％、pH 6.0.在上述培养条件下,重组巴斯德毕赤酵母产内切几丁质酶的活力高达30.92U/mL.与未优化前相比,酶活力提高了1.44倍.研究结果为内切几丁质酶的产业化生产和应用奠定了良好基础.

[目的]挖掘新颖的低温α-淀粉酶基因资源,并对其适冷机制进行分析,可以加深我们对低温酶的认识并为酶分子改良提供科学依据.[方法]根据嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus) JCM12803全基因组序列信息,利用PCR的方法获得一个α-淀粉酶基因Tcamy,将其插入至表达载体pPIC9后,在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115中异源表达,测定其酶学性质.同时采用氨基酸序列分析和同源建模的方法获得其三维结构,分别从蛋白序列-结构-功能层面上研究其适冷机制.[结果]TcAmy是一个典型的低温α-淀粉酶,最适温度35℃,在0℃下保持有27％的活性.序列和结构分析表明该酶N-糖基化修饰程度低,Arg和Pro含量低而Gly含量高且二硫键和离子键较少.[结论]本研究获得了一个低温α-淀粉酶,低N-糖基化以及特殊的氨基酸组成和蛋白分子内作用力是其适应低温的根本原因.

本研究利用巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris蛋白表达体系表达了药用担子菌桦褐孔菌的一个二肽酶基因.该二肽酶基因编码区全长1 814bp,包含6个内含子,编码465个氨基酸.生物信息学分析发现,二肽酶基因编码的蛋白中不含信号肽序列,但在第55-77位氨基酸之间存在一个跨膜结构.将含跨膜结构和去跨膜结构蛋白的cDNA序列分别克隆到酵母分泌型表达载体pPICZαA上,电转化至巴斯德毕赤酵母X-33中,用1％(v/v)甲醇诱导重组菌株表达目标蛋白,采用SDS-PAGE和Western-blot检测表达蛋白.结果 显示,巴斯德毕赤酵母可表达含跨膜结构的完整基因,但目标蛋白不能分泌到胞外,存在于破碎细胞的沉淀中,且没有催化活性;而去跨膜结构的蛋白则可分泌表达到胞外,并具有催化活性.Ni-NTA纯化去跨膜结构的桦褐孔菌二肽酶浓度可达0.12mg/mL,并发现其在pH 7.3、反应温度50℃、反应时间2h的条件下,以Gly-Gly为底物时,其比活为433U/mg.同时检测到其对Ile-Leu、Trp-Trp和Phe-Phe具有较高的水解活性.