[目的]谷氨酸棒杆菌是一种重要的工业微生物,挖掘可调控性元件可有效拓展谷氨酸棒杆菌研究和应用的广度和深度.[方法]在谷氨酸棒杆菌组成型强启动子PH10 上嵌入阻遏蛋白CymR结合的操纵序列CuO,构建了 4-异丙基苯甲酸(Cumate)为诱导剂的启动子PH10-CuO.[结果]绿色荧光蛋白作为报告基因的实验结果显示,无诱导剂时,谷氨酸棒杆菌工程菌相对荧光强度较低;以 25 μg/mL 4-异丙基苯甲酸诱导 12 h时,谷氨酸棒杆菌工程菌荧光强度达 62 000,证明PH10-CuO具有很好的严谨性和诱导表达强度.构建了以启动子PH10-CuO调控recET和Cas12a表达的谷氨酸棒杆菌基因编辑质粒,实现谷氨酸棒杆菌染色体上靶标基因的精准编辑和外源基因插入.[结论]诱导型启动子PH10-CuO具有表达强度高且渗漏表达低的特点,可用于谷氨酸棒杆菌中被其调控基因的时序性表达.

[背景]口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的感染牛、羊和猪等偶蹄动物的主要疫病之一.口蹄疫病毒的结构蛋白VP1 包含多个能够引起机体免疫反应的主要位点,因此 VP1 是研究亚单位疫苗的方向靶标.谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)作为安全生产菌株,是医药用蛋白生产的优势细胞工厂.[目的]利用C.glutamicum作为受体菌株表达外源蛋白的优势实现VP1 的外源表达.[方法]根据VP1 结构蛋白的基因序列、相应功能和C.glutamicum的密码子偏好性设计并合成VP1 基因,与pXMJ19载体连接构成重组质粒pXMJ19-VP1.C.glutamicum CGMCC 1.15647 菌株用于表达VP1-6×his蛋白,并对蛋白表达元件启动子、5′非翻译端(5′UTR)、目的蛋白自身N端等进行优化,同时对培养条件等进一步优化,采用SDS-PAGE和Western blotting技术检测VP1 蛋白的表达情况.最后应用间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定本研究中生产的VP1 的免疫活性.[结果]SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明VP1 蛋白能在C.glutamicum CGMCC 1.15647 菌株成功表达,将Ptac启动子替换为合成型启动子PH36 能提高蛋白产量.在此基础上,通过插入不同的 5′UTR序列和VP1 蛋白N端氨基酸的改变能进一步提高蛋白产量并可利用CspB信号肽实现分泌表达.发酵试验表明,VP1 摇瓶发酵培养最优条件为 30℃、24 h.ELISA试验表明,本研究中的 VP1 可与阳性血清特异性结合.[结论]本研究在谷氨酸棒状杆菌中成功表达 FMDV的VP1蛋白,并通过优化蛋白表达元件的方法进一步提高了产量,为开发新型FMD免疫诊断试剂和安全高效的亚单位疫苗奠定了良好的基础.

[目的]探究与挖掘不同生长时期谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中潜在的小的非编码RNA(small non-coding RNA,sRNA).[方法]检测不同时期和不同工业改造的谷氨酸棒杆菌菌株的RNA-Seq数据构建表达文库,通过sRNA-Detect和APERO两种方法构建潜在的sRNA数据库.以逆转录PCR检测(real-time reverse transcription PCR,RT-PCR)方法检测sRNA的表达,并通过生物信息学方法分析潜在sRNA的调控位点、二级结构及保守结构域.[结果]构建了包含2 653条潜在sRNA的数据库,依据其相较于编码序列(coding sequence,CDS)区域的位置进行分类、预测功能.发现了在高GC革兰氏阳性菌中普遍存在的sRNA00130,随生长时期表达量变化的sRNA00257,常时高表达的sRNA02036、sRNA02037等sRNA.依据自由结合能预测潜在sRNA可能的结合位点、二级结构,预测结果显示潜在的sRNAs同多种细胞复制、代谢通路基因相关.大多数潜在sRNA仅在谷氨酸棒杆菌中具有保守性.[结论]谷氨酸棒杆菌潜在sRNA的发掘对于填补谷氨酸棒杆菌生长调控机制的空缺具有重要作用,提供了新的可能的调控工具与改造位点.

γ-氨基丁酸可由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)催化谷氨酸一步合成,反应体系成分简单、环境友好.然而,绝大多数GAD酶催化pH偏酸性且反应范围狭小,需要加入无机盐维持最适催化环境,增加了生产附加成分.此外,随着产物 γ-氨基丁酸的生成,溶液 pH 会逐渐上升,不利于 GAD 酶的持续转化.本研究首先从实验室保藏的一株高产 γ-氨基丁酸的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆得到谷氨酸脱羧酶LpGAD,基于酶蛋白表面电荷修饰,选择 9 个位点进行定点突变及组合突变,酶学性质表征结果显示三突变体 LpGADS24R/D88R/Y309K在催化 pH 区间内酶活力整体提高,尤其拓宽了在偏中性pH 6.0下的酶活,为野生酶的1.68倍.接下来,通过分子动力学模拟解析了酶活提高的机理.此外,将Lpgad与LpgadS24R/D88R/Y309K突变基因分别在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)E01 中过表达,通过优化确定了摇瓶最适转化条件为反应温度40℃,菌体量OD600=20,底物L-谷氨酸 100.0 g/L,5-磷酸吡哆醛添加量为 100 μmol/L.5 L发酵罐中,不调节 pH,通过分批投料底物 L-谷氨酸,γ-氨基丁酸产量高达 402.8 g/L,较对照菌株提高了1.63倍.本研究成功拓宽了LpGAD的pH催化范围及酶活,提高了γ氨基丁酸的转化效率,为实现其规模化工业生产奠定了基础.

L-缬氨酸作为一种支链氨基酸,广泛应用于医药和饲料等领域.本研究借助多种代谢工程策略相结合的方法,构建了生产 L-缬氨酸的微生物细胞工厂,实现了 L-缬氨酸的高效生产.首先,通过增强糖酵解途径、减弱副产物代谢途径相结合的方式,强化了L-缬氨酸合成前体丙酮酸的供给;其次,针对L-缬氨酸合成路径关键酶—乙酰羟酸合酶进行定点突变,提高了菌株的抗反馈抑制能力,并利用启动子工程策略,优化了路径关键酶的基因表达水平;最后,利用辅因子工程策略,改变了乙酰羟酸还原异构酶和支链氨基酸转氨酶的辅因子偏好性,由偏好NADPH转变为偏好NADH,从而提高了 L-缬氨酸的合成能力.在 5 L 发酵罐中,最优谷氨酸棒杆菌工程菌株Corynebacterium glutamicum K020 的L-缬氨酸产量、得率和生产强度分别达到了 110 g/L、0.51 g/g和 2.29 g/(L?h).

L-谷氨酸是世界上第一大宗氨基酸产品,广泛应用于食品医药及化工等行业.以谷氨酸高产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01 为出发菌株,首先通过敲除主要副产物丙氨酸合成相关基因-丙氨酸氨基转移酶编码基因(alaT),降低了发酵副产物丙氨酸含量.其次,α-酮戊二酸节点碳流量对谷氨酸合成起重要作用,因此,采用核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)序列优化降低了α-酮戊二酸脱氢酶的活性,强化了谷氨酸合成代谢流.同时通过筛选不同来源的谷氨酸脱氢酶,加强了α-酮戊二酸内源转化为谷氨酸的能力.接着,对谷氨酸转运蛋白进行理性设计,提高了谷氨酸的外排能力.最后,对基于以上策略构建的整合菌株进行了 5 L发酵罐发酵优化,通过梯度升温结合分批补料策略,谷氨酸产量为(136.33±4.68)g/L,较原始菌的产量(96.53±2.32)g/L提高了 41.2%;糖酸转化率为 55.8%,较原始菌的 44.2%提高了 11.6%;且降低了副产物丙氨酸的含量.以上策略一定程度上提高了谷氨酸的产量与糖酸转化率,可为谷氨酸生产菌株的代谢改造提供参考.

碱基编辑是一种新兴的基因组编辑技术,具有不产生双键断裂、不依赖同源重组且不需要添加外源模板的优势,在真核及原核生物中得到了广泛的开发与应用.为了进一步扩展碱基编辑技术在谷氨酸棒杆菌中的基因组覆盖范围,本研究将 3种PAM限制较为宽松的新型Cas9 突变体应用于胞嘧啶碱基编辑工具中,分别为近乎PAMless的SpRY突变体(NRN>NYN PAM)、SpG突变体(NGN PAM),以及ScCas9++蛋白(NNG PAM),实现对碱基编辑工具的PAM拓展.结合SpRY突变体的碱基编辑系统展示出了更宽松的PAM识别,除对CAT、CAC、TAA PAM的位点完全没有编辑外,对其他NRN种类的PAM位点均出现了不同程度的识别,但整体编辑效率低,难以推广应用;结合SpG突变体的碱基编辑系统可实现对所有NGN种类 PAM位点的编辑,且编辑效率优于SpRY突变体,但对NGG PAM位点的编辑,相比原始Cas9 蛋白,编辑效率下降 9.3%-55.9%;结合ScCas9++蛋白的碱基编辑系统,除对TCG、CTG PAM的基因组位点没有编辑外,可实现对其他测试NNG PAM的基因组位点编辑,大部分位点基因组编辑效率均较高,最高可达 100%.本研究的开展不仅有助于碱基编辑工具在谷氨酸棒杆菌中覆盖更多的基因组位点,同时也为其他基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑工具的PAM拓展提供有力的参考.

L-苯丙氨酸(L-Phe)是重要的食品及医药中间体,但由于其生物合成途径较长且调控机制复杂,仅依靠质粒或者周期漫长的基因组逐轮改造,难以实现各个模块之间的通量平衡,在一定程度上限制了其产量的进一步提升.本研究将L-Phe生物合成途径中的 7 个携带组成型启动子PF11 及核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)为GGGGGGGG的关键基因ppsA、tktA、aroFfbr、aroE、aroL、pheAfbr和tyrB,整合到谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的基因组中;利用课题组前期研发的基于CRISPR/Cas系统和胞苷脱氨酶的无模板基因表达调控技术(base editor-targeted and template-free expression regulation,BETTER),对每个关键基因的RBS进行同步编辑,生成富含G/A的RBS突变文库;利用前期开发的荧光蛋白型L-Phe生物传感器结合液滴微流控系统(droplet microfluidics)对RBS突变文库进行高通量筛选.最终,从大约 7 万个RBS突变文库中筛选到 4 株L-Phe产量提升不同程度的突变菌株,其 72 h摇瓶发酵产量分别为 2.06、1.30、4.42 和 7.44 mmol/L,相比对照菌株C.g-2(0.6 mmol/L)分别提高了2.43、1.17、6.37、11.40 倍.利用碱基编辑器同时调节多基因的表达水平并筛选组合文库,可以为L-Phe工程育种提供一种可行策略.

天冬氨酸激酶(Aspartate Kinase,AK)是赖氨酸合成途径中关键酶,其受到代谢产物赖氨酸与苏氨酸的协同抑制,旨在发现其解除协同抑制的新突变体并解析其机理.通过对赖氨酸高产菌Corynebacterium glutamicum ZL5与野生型C glutamicumATCC 13032的天冬氨酸激酶氨基酸序列比对,发现在高产菌的天冬氨酸激酶中存在G359D突变.通过体外天冬氨酸激酶野生型和G359D突变体酶活检测,发现该G359D突变体在10 mmol/L赖氨酸和苏氨酸同时存在时仍保留了76.94％±1.61％的酶活,而野生酶的酶活仅残留4.38％±1.28％.这一结果在赖氨酸高产菌谷氨酸棒杆菌的回复突变中也可得到验证,其回复突变后使赖氨酸产量下降15.57％.通过同源建模和结构分析发现,与野生酶相比,G359D突变体结合赖氨酸后,其位于活性中心附近的Arg1”与Glu”之间无法形成离子键,允许底物分子的结合而具有较高活性.发现天冬氨酸激酶G359D突变体可阻断赖氨酸引起的别构效应,从而有效解除赖氨酸与苏氨酸的协同抑制.

利用基于气相色谱-质谱联用(GC-MS)的代谢组学分析方法,研究Corynebacterium glutamicum ATCC 13032和C.glutamicum ATCC 13032AargGΔargR-pXMJ19-argB(ec) (CIT4)重组菌胞内代谢物差异性,挖掘L-瓜氨酸合成关键代谢物及代谢途径作用机制,并通过添加关键代谢物进行理性强化,提高L-瓜氨酸的产量.利用GC-MS共检测124种化合物,结合主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS)统计发现10种为区别这两种菌的生物标志物,理性强化添加α-酮戊二酸、丙酮酸、谷氨酸、鸟氨酸、氨甲酰磷酸和谷氨酰胺,CIT4中L-瓜氨酸产量从18.50 g/L增加到20.86 g/L.