近年发展起来的人工核酸酶可通过引起特定位点的DNA双链断裂实现对目的片段的有效编辑.为进一步提高碱基修改的效率和精确度,2016年研究者们利用CRISPR/Cas9识别特定DNA序列的功能,结合胞嘧啶脱氨酶的生化活性发明了将胞嘧啶高效转换为胸腺嘧啶(C＞T)的嘧啶单碱基编辑系统(base editor).这一系统虽然能精准实现嘧啶直接转换,大大提高精确基因编辑效率,但美中不足的是无法对嘌呤进行修改.近期,Nature 报道了将细菌中的tRNA腺嘌呤脱氨酶定向进化形成具有催化DNA腺嘌呤底物的脱氨酶,将其与Cas9系统融合发明了具有高效催化腺嘌呤转换为鸟嘌呤的新工具—腺嘌呤单碱基编辑系统(ABEs,adenine base editors).本文总结了单碱基编辑工具的发展历程和最新研究进展,着重介绍ABEs的研发过程,并对单碱基编辑工具今后的应用方向和研发方向进行展望.

碱基编辑器是近两年发展起来的新型基因组编辑工具,它将碱基脱氨酶的催化活性和CRISPR/Cas系统的靶向特异性进行结合,催化DNA或RNA链上特定位点的碱基发生脱氨基反应,进而完成碱基的替换.碱基编辑器分为DNA和RNA碱基编辑器两大类,其中DNA碱基编辑器分为两种:胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器;前者可以实现胞嘧啶到胸腺嘧啶的转换,而后者则可以将腺嘌呤突变为鸟嘌呤.由于DNA碱基编辑器不会造成DNA的双链断裂(DSB),也不依赖于宿主的非同源末端修复和同源重组途径,因此,大大减少了DSB相关的编辑副产物,如小片段插入或缺失等.基于CRISPR/Cas系统的RNA碱基编辑器,可以实现RNA链上腺嘌呤核苷到次黄苷的转换.本文对不同类型碱基编辑器的开发过程、适用范围和编辑特点等进行梳理,并对其在细菌基因组编辑中的应用进行了介绍;最后简要探讨了细菌中碱基编辑器的缺点以及将来可能的研究方向.

碱基编辑技术,以CRISPR/Cas系统为平台,引导胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶至特定的基因组靶点,产生靶向性的C至T或者A至G的碱基转换.自碱基编辑技术问世以来,全球多个科研团队通过优化改进得到了一系列高精准性、广靶向性、小编辑框、普适性的碱基编辑器.在应用方面,碱基编辑器能够在人体细胞、动植物细胞以及胚胎中进行高效的碱基转换,在治疗人类遗传病、构建动物疾病模型、植物育种等方面具有巨大的应用潜能.本文就碱基编辑技术的发展、优化和应用等方面进行综述和展望.

碱基编辑技术(base editing)是基于CRISPR/Cas系统发展起来的新型靶基因修饰技术,目前依据碱基修饰酶的不同可分为胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor,CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor,ABE).这两类碱基编辑系统利用胞嘧啶脱氨酶或人工进化的腺嘌呤脱氨酶对靶位点进行精准的碱基编辑,最终可以分别实现C-T(G-A)或A-G(T-C)的碱基替换.碱基编辑技术自2016年被开发以来,因其高效、不依赖DNA双链断裂产生、无需供体DNA参与等优势,已经成功应用在各种动物、植物及其他生物中,为基因治疗及精准作物育种等领域提供了重要技术支撑.本文从碱基编辑技术的特点、开发过程、优化、应用、脱靶效应及改善策略等方面进行了系统介绍,最后对未来需要迫切解决的一些问题进行了分析和展望,以期为相关领域的科研人员进一步了解、使用及优化碱基编辑系统提供参考.

CRISPR/Cas系统是现阶段应用最广泛的基因组编辑工具,但由于其激活同源重组进行DNA修复的效率低且存在脱靶效应,严重限制了该工具在基因治疗方面的应用.碱基编辑是一种基于CRISPR/Cas系统的基因编辑新策略,其工作原理是利用其结合的碱基脱氨酶精确编辑目标DNA或RNA上一小段窗口内的核苷酸.碱基编辑系统包括胞嘧啶碱基编辑系统(CBEs)和腺嘌呤碱基编辑系统(ABEs),可以分别实现碱基对C·G到T·A和A·T到G·C的转换.碱基编辑系统作用过程中不依赖于DNA双链断裂的发生,无需引入供体DNA,并因其高效性及特异性已被广泛应用于遗传性疾病治疗的研究中.本文综述了近年来碱基编辑系统的发展历程和在遗传性疾病治疗中的潜力,并对其作为基因治疗药物的发展前景进行了展望.

CRISPR系统能够在基因组DNA中完成精准编辑,但依赖于细胞内的同源重组(Homology directed recombination,HDR)修复途径,且效率极低.基于CRISPR/Cas9系统开发的碱基编辑技术(Base editing)通过将失去切割活性的核酸酶与不同碱基脱氨基酶融合,构建了两套碱基编辑系统(Base editors,BE):胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor,CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor,ABE).这两类编辑器分别能够在不产生DNA双链断裂的前提下在基因靶位点完成C＞T(G＞A)或A＞G(T＞C)的替换,最终实现精准的碱基编辑.目前碱基编辑技术已经广泛应用于基因治疗、动物模型构建、精准动物育种和基因功能分析等领域,为基础和应用研究提供了强大的技术工具.文中概括了碱基编辑技术的研发过程、技术优势、应用现状、存在问题及改进策略,以期为相关领域的科研人员了解和使用碱基编辑系统提供参考.

目的:探究大车前苷(plantamajoside,PMS)联合二甲双胍(metformin,MET)对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡和自噬的影响.方法:将HepG2细胞分为Control组、PMS组、MET组和MET+PMS组,分别采用15 mmol·L-1 MET及250 mg·L-1 PMS单独或联合干预24h后,采用溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)染色检测HepG2细胞增殖情况;赫斯特(Hoechst)染色检测HepG2细胞凋亡情况;RT-qPCR检测Beclinl mRNA、p62 mRNA及LC3ⅡmRNA的表达;蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测肿瘤增殖抗原Ki67、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、Caspase-9、Beclin1、p62、微管相关蛋白1轻链3 Ⅱ(microtubule-assaiated pro-tein 1 light chain 3 Ⅱ,LC3Ⅱ)/LC3Ⅰ、磷脂酰肌醇-3-羟激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinases B,AKT)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)及p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达;免疫荧光法检测LC3阳性的细胞数及加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)后LC3阳性的细胞数.结果:与Control组比较,MET+ PMS组细胞的增殖率、Ki67、PCNA、p62、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT及p-mTOR/mTOR的表达显著降低(P＜0.05);细胞凋亡率、LC3阳性细胞数及Caspase-3、Caspase-9、Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达显著升高(P＜0.05);且加入自噬抑制剂3-MA后,3-MA+MET+ PMS组LC3阳性细胞数显著低于MET+ PMS组.结论:大车前苷可增强二甲双胍对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用,促进HepG2细胞凋亡和自噬.

雷替曲塞是新型的细胞毒药物,为喹啉叶酸盐类似物,是胸甘酸合成酶( TS )特异性水溶性抑制剂,1996年在英国研发成功上市,随后欧洲多个国家和地区批准上市用于肿瘤治疗,雷替曲塞也获得了中国国家食品药品监督管理局的批准,治疗不适合5-氟尿嘧啶( FU )的晚期肠癌患者.雷替曲塞是经还原型叶酸/甲氨蝶呤细胞膜载体转运进入细胞内部,被代谢成多聚谷氨酸类化合物,通过抑制胸苷酸合成酶使肿瘤细胞的DNA断裂,促进细胞死亡发挥抗癌作用〔1〕,该过程使细胞内的药物无法流到细胞外,所以,雷替曲塞在细胞内的药物浓度变大,在细胞内的停留时间变长,加强了其对TS 的抑制作用,抗肿瘤作用增强〔2〕.FU 也是TS 抑制剂之一,不良反应为消化道反应、黏膜反应、骨髓抑制等,心脏毒性发生率在化疗药物中处于第二位〔3,4〕.5-FU引起心脏毒性的可能机制有:FU引起冠状动脉痉挛导致心肌缺血〔5〕;直接损伤心肌及冠状动脉血管内皮,致内皮细胞功能异常;FU 经二氢嘧啶脱氢酶DPD代谢成a-氟-β-丙氨酸,再代谢为氟柠檬酸参与三羧酸循环,进而使腺嘌呤核苷三磷酸( ATP)数量减少,导致心脏毒性增加〔6〕.但雷替曲塞与FU的抗肿瘤作用机制不同〔7〕,雷替曲塞不需要经过DPD酶代谢,避免了代谢产物积累,心脏毒性的发生率减少.两种药不存在交叉耐药,有研究〔8〕分析了42例因FU心脏毒性换用雷替曲塞的肠癌患者,即使预防性抗心绞痛治疗再使用FU类药物,心脏毒性再发率仍达20％,而雷替曲塞替代治疗者未见心脏毒性.雷替曲塞给药方便,不良反应少,对于FU类药物引起的心脏毒性或有心脏疾患的老年患者,雷替曲塞是安全有效的药物〔9〕.雷替曲塞已在多种老年实体恶性肿瘤中使用,包括消化道肿瘤及恶性胸膜瘤等〔9,10〕.本文对近年来雷替曲塞治疗肿瘤的国内外基础及临床研究现状和最新进展进行综述.

目的 通过检测Secoemestrin C(Sec C)对肺腺癌细胞增殖的影响,观察内质网应激相关基因及细胞信号通路的变化,揭示Sec C在抑制肺腺癌增殖过程的作用机制,为肺腺癌治疗药物的开发提供新的思路.方法 以不同浓度梯度的Sec C处理肺腺癌A549和H1299细胞,观察细胞的形态学变化和生长增殖情况,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和平板克隆实验测定Sec C对A549和H1299细胞增殖的影响;5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(EdU)检测法测定Sec C对A549和H1299细胞DNA复制的影响;Western blot法探究Sec C对A549和H1299细胞内质网应激和细胞凋亡相关蛋白的表达变化.结果 光镜下观察发现Sec C对A549和H1299具有杀伤作用,IC50分别为2.164和2.341μmol/L;克隆形成实验结果表明Sec C能够抑制A549和H1299细胞的增殖能力,且呈浓度依赖;EdU实验结果证明Sec C能够显著抑制DNA复制.Western blot结果表明,Sec C会引起内质网应激相关蛋白免疫球蛋白结合蛋白(BiP)、活化转录因子4(ATF4)、磷酸化的真核生物起始因子2(p-eIF2)、1型内质网转膜蛋白激酶(IRE1α)表达增多,其作用呈时间和浓度依赖性;Sec C可诱导细胞凋亡,使半胱氨酸天冬氨酸酶3(caspase3)、半胱氨酸天冬氨酸酶7(caspase7)、多聚腺嘌呤二核苷酸核糖聚合(PARP)的表达显著降低,以及活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved-caspase3)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶7(cleaved-caspase7)、凋亡剪切产物聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(cleaved-PARP)的表达显著增多,其作用呈时间和浓度依赖性.结论 Sec C能明显抑制肺腺癌细胞的增殖活性,其作用机制可能通过内质网应激诱导细胞凋亡.