目的 基于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)诱导表达系统制备呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial vi-rus,RSV)口服疫苗,并对其免疫原性进行分析.方法 将构建的质粒pUC57-Pre F与pNZ8149分别经Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切,酶切产物经T4 DNA连接酶连接后获得重组质粒pNZ8149-Pre F,电转化至感受态L.lactis NZ3900,经乳糖培养基筛选获得非分泌型重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F,以nisin A为诱导剂诱导表达,经Western blot和免疫荧光标记对其表达产物进行分析;将雌性BALB/c小鼠随机分为PBS、L.lactis NZ3900/pNZ8149、L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F组,15只/组,每只口服500 μL,于第1、2天进行初次免疫,第16、17天进行加强免疫,第14和28天经小鼠下颌取血并分离脾脏细胞,ELSIA法检测重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F诱导的体液和黏膜免疫应答水平,ELISpot法检测重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F诱导的细胞免疫应答水平.结果 重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F经PCR及测序鉴定,证明构建正确;抗原蛋白Pre F特异性地表达在L.lactis NZ3900中,相对分子质量约 50 000;初次免疫后第 14 和 28天,与 PBS 和L.lactis NZ3900/pNZ8149组相比,L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F组小鼠血清Pre F-特异性IgG抗体效价、肠洗液中特异性分泌型IgA抗体以及脾脏细胞中IFNγ和IL-4分泌水平均明显升高,且差异均有统计学意义(t=-30.268～-3.087,P均＜0.05).结论 基于L.lactis诱导表达系统构建的RSV 口服疫苗具有较强的免疫原性,为研发RSV黏膜疫苗提供了参考,也为开发其他病毒或细菌口服疫苗提供了新的研究策略及方法.

目的 设计通用甲型流感病毒DNA疫苗,并检测其在小鼠体内的免疫效力.方法 合成含H1N1、H3N2、H9N2亚型甲型流感病毒M2(3M2e)胞外结构域的DNA序列,克隆至载体pVAX1中,构建真核表达质粒pVAX1-3M2e.将质粒pVAX1-3M2e分别与细胞穿透肽(cell penetrating peptides,CPPs)RVG9dR、Protamine、RVG9dR+Protamine 多肽复合物(质量分数1∶1)按不同质量分数混合(1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8),进行凝胶阻滞试验,以确定DNA与CPPs的正确结合;并通过细胞荧光试验在细胞水平(293T细胞)检测CPPs的递送效率.选择RVG9dR+Protamine递送质粒pVAX1-3M2e经肌内免疫雄性BALB/c小鼠(多肽复合物两种剂量:25 μg pVAX1-3M2e+500 μg多肽复合物、50 μg pVAX1-3M2e+1000 μg多肽复合物,每组8只小鼠),检测通用甲型流感病毒DNA疫苗对3种亚型流感病毒(H1N1、H3N2、H9N2)的交叉保护作用.结果 DNA与RVG9dR、Protamine、RVG9dR+Protamine的最佳结合比分别为1∶2、1∶2、1∶1;RVG9dR+Protamine在1:20的质量分数下对质粒pVAX1-3M2e具有超强的递送效率;50 μg pVAX1-3M2e+1 000 μg多肽复合物对3种亚型流感病毒攻毒组小鼠的保护率均为100％.结论 由RVG9dR+Prot-amine多肽复合物递送的质粒pVAX1-3M2e在小鼠中提供了针对3种亚型甲型流感病毒的交叉保护.

目的 制备不同浓度的兔软骨脱落细胞支架,并评估其理化性能和干细胞的相容性,为软骨修复提供实验依据.方法 Percoll密度分离法培养骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),并进行流式细胞学鉴定和成骨、成软骨分化能力检测.从兔膝、股关节中切取软骨片,进行物理粉碎、反复冻融以及各种酶混合消化脱细胞.为比较并观察不同浓度脱细胞支架的理化性能差异,设计3组支架,浓度分别为100％(A组)、50％(B组)、30％(C组),每组3只.将第3代PKH26示踪的BMSCs接种于最适浓度支架上培养1周,观察细胞生长情况.结果 流式技术检测BMSCs表面抗原,CD44、CD90呈阳性表达,CD45阴性表达;成骨诱导茜素红染色可见红色钙结节;软骨诱导阿利新蓝染色见软骨结节呈蓝色;3组支架经苏木素-伊红(HE)、甲苯胺蓝染色后未观察到明显细胞形态.样本脱细胞后的DNA浓度与未脱支架的指标均值差异具有显著性(P＜0.05).糖胺聚糖含量较正常值稍偏低.3组支架两两比较孔径、吸水膨胀率、孔隙率、支架断裂强度、杨氏模量差异具有显著性(P＜0.05);干细胞与支架共培养后细胞附着良好.结论 Percoll密度分离法可获取高纯度的兔BMSCs;应用混合脱细胞方法脱细胞较彻底.B组支架可作为构建组织工程软骨修复的最适方案.体外培养的BMSCs在B组支架生长良好.

目的 探讨微小RNA(miR)-19b对冠心病大鼠血管内皮细胞损伤的影响及磷酸酶及张力蛋白同源物/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PTEN/PI3K/AKT)信号通路的作用.方法 选取72只大鼠随机分为正常组、模型组、模拟对照物(NC)组、miR-19b组、miR-19b+质粒互补DNA(pcDNA)3.1组、miR-19b+PTEN组.采用高脂饲料+垂体后叶素建立冠心病模型,尾静脉注射miR-19b mimic、pcDNA3.1-PTEN慢病毒液构建miR-19b、PTEN过表达大鼠.采用荧光定量聚合酶链反应检测冠状动脉组织miR-19b和PTEN信使RNA(mRNA)水平,测定大鼠心功能,观察大鼠冠状动脉病理变化,检测心肌组织细胞凋亡情况、血管内皮功能、冠状动脉中PTEN/PI3K/AKT信号通路、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved Caspase)-3、cleaved Caspase-9水平.分离培养冠心病大鼠冠状动脉内皮细胞,根据转染方式分为野生型质粒(WT)+NC组、WT+miR-19b mimic组、突变型质粒(MUT)+NC组、MUT+miR-19b mimic组,采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-19b与PTEN的靶向关系.将冠心病大鼠冠状动脉内皮细胞分为正常细胞组、NC细胞组和miR-19b细胞组,检测PTEN mRNA和PTEN蛋白水平.结果 miR-19b组左心室射血分数(LVEF)、miR-19b、血清血管内皮生长因子(VEGF)、一氧化氮(NO)、磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶(p-PI3K)/PI3K蛋白、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)/AKT蛋白水平高于模型组,左心室收缩末期容积(LVESV)、舒张末期容积(LVEDV)、细胞凋亡率、cleaved Caspase-3 和 cleaved Caspase-9、PTEN mRNA、内皮素-1(ET-1)、PTEN 蛋白水平低于模型组,差异均有统计学意义(P＜0.05).miR-19b+PTEN 组 LVESV、LVEDV、细胞凋亡率、PTEN mRNA、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、ET-1、VEGF、PTEN 蛋白水平高于 miR-19b 组,LVEF、NO、p-PI3K/PI3K 蛋白和p-AKT/AKT蛋白水平低于miR-19b组,差异均 有统计 学意义(P＜0.05).模型组LVEF、miR-19b、VEGF、NO、p-PI3K/PI3K蛋白、p-AKT/AKT蛋白水平低于正常组,LVESV和LVEDV、细胞凋亡率、PTEN mRNA、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、ET-1、PTEN蛋白水平高于正常组,差异均有统计学意义(P＜0.05).与正常组比较,模型组大鼠冠状动脉内皮细胞排列紊乱,并伴有明显的水肿.与模型组比较,miR-19b组冠状动脉组织病理损伤明显减轻.WT+miR-19b mimic组细胞中荧光素酶相对活性低于 WT+NC组、MUT+NC 组、MUT+miR-19b mimic 组,差异均有统计学意义(P＜0.05).miR-19b mimic 细胞组 PTEN mRNA和PTEN蛋白水平低于正常细胞组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 miR-19b靶向抑制PTEN,激活PI3K/AKT信号通路,保护冠心病大鼠心功能和血管内皮功能,减少心肌细胞凋亡.

类风湿关节炎(RA)是一种复杂的自身免疫性疾病,现有治疗手段虽能缓解症状,但长期使用副作用明显.近年来,中性粒细胞胞外陷阱(NETs)作为RA病理过程中的关键因素受广泛关注.NETs由活化的中性粒细胞释放,含有DNA和抗菌蛋白,不仅参与免疫防御,还通过多种机制加剧RA的病理进展.调控肽基精氨酸脱亚胺酶4、活性氧生成及脱氧核糖核酸酶等可减少NETs的形成和积累,促进NETs清除.这些方法在实验和动物模型中展现良好前景,但临床应用仍需进一步研究验证.随着基因编辑和纳米医学发展,NETs有望为RA的精准治疗提供新的解决方案,改善患者预后和生活质量.深入研究NETs在RA中的作用机制有助于开发新的治疗策略,为RA患者提供更有效的治疗手段.

前列腺癌是男性中第二常见的恶性肿瘤,过去10年间,前列腺癌生物标志物的研究取得显著进展,尤其在尿液和血液检测领域.液体活检是一种微创方法,通过检测循环肿瘤细胞、细胞游离DNA和细胞外囊泡(EVs)中的癌症相关分子,揭示癌症的异质性和获得耐药性.EVs作为细胞衍生的囊泡,内含核酸、蛋白质和脂质等多种分子,可从癌症患者的尿液、血浆和血清中分离.EVs的分泌不仅促进癌症的进展、转移和耐药性,还可作为诊断高级别前列腺癌及预测去势抵抗性前列腺癌疾病进展的有效工具.本文综述EVs在去势抵抗性前列腺癌诊断和疾病进展预测中的应用,并探讨其在癌症进程中的生物学功能.

目的 探讨序列相似性家族107成员A(FAM107A)调控缺氧诱导因子3A(H1F3A)对前列腺癌(PCa)迁移、侵袭、凋亡的影响.方法 通过生物信息学技术筛选目的基因并进行分析.体外培养人PCa细胞PC-3,采用反转录病毒稳定转染,采用蛋白质印迹法(Western blot)技术验证HIF3A及DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达量;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;焦磷酸测序检测启动子甲基化程度;细胞功能试验验证对PCa迁移和侵袭的影响.两组间差异表达采用独立样本t检验方法比较.结果 生信分析提示FAM107A基因在PCa组织中表达低于正常前列腺组织(P＜0.01),Gleason评分(GS)越高,FAM107A表达量越低(P＜0.01).划痕实验、Transwell侵袭实验提示过表达 FAM107A会抑制 PCa 细胞的迁移(C4-2:0.337±8.930 比 29.334±2.651,t=-7.260,P＜0.05;PC-3:18.672±10.494 比 52.043±3.512,t=-6.024,P＜0.05)、侵袭(DU145:117.703±12.845 比 242.303±21.401,t=10.273,P＜0.05;PC-3:51.674±9.502 比 139.303±13.394,t=16.025,P＜0.05),促进凋亡(17.180±0.700 比 0.527±0.121,t=40.600,P＜0.05).细胞周期实验表明oe-FAM107A-ENZ组细胞G1期比例高于对照组(80.410±0.786比35.583±0.714,t=73.130,P＜0.05),S 期比例低于对照组(11.233±0.374 比 38.747±1.809,t=25.790,P＜0.05),细胞分裂被阻滞在S期.蛋白免疫印迹实验证明过表达FAM107A组的DNMT1表达量低于对照组(0.277±0.032 比 0.900±0.026,t=25.93,P＜0.05),HIF3A 表达量高于对照组(0.657±0.040 比0.523±0.043,t=4.041,P＜0.05).sh-FAM107A-5-aza 组的 HIF3A 的表达量明显恢复(0.550±0.020比0.427±0.067,t=3.073,P＜0.05).蛋白免疫印迹实验证明过表达FAM107A时E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达量高于对照组(0.773±0.095 比 0.307±0.046,t=7.683,P＜0.05),N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达量低于对照组(0.380±0.060 比 0.733±0.045,t=8.154,P＜0.05),波形蛋白(Vimentin)表达量低于对照组(0.347±0.107 比 0.700±0.040,t=5.361,P＜0.05).结论 FAM107A高表达可抑制HIF3A启动子甲基化促进其表达,进而抑制PCa的迁移、侵袭,是PCa进展的生物标志物.

目的 探讨DNA甲基转移酶-1(DNMT1)在人脑胶质瘤细胞中的生物学功能及其调控机制.方法 利用中国胶质瘤基因组图谱(CGGA)、肿瘤基因组图谱(TCGA)、基因表达综合数据库(GEO)中脑胶质瘤相关转录组测序(mRNA-seq)数据、单细胞测序数据,对迁移调控蛋白1(SHTN1)进行生存分析、临床相关分析等生物信息学分析;采用慢病毒转染构建DNMT1稳定低表达的人脑胶质瘤细胞株,以DNMT1-NC为对照,使用实时定量聚合酶链反应检测各组细胞SHTN1 mRNA水平,以验证DNMT1与SHTN1的表达相关性;BSAS测序验证DNMT1对SHTN1的甲基化调控作用,采用Kruskall-Wallis检验比较每个CpG位点甲基化差异.结果 SHTN1高表达组脑胶质瘤患者生存优于低表达组(P＜0.05);SHTN1在胶质母细胞瘤(GBM)中的表达水平显著低于正常脑组织,并且SHTN1在不同脑胶质瘤WHO分级和不同病理亚型中表达差异有统计学意义;人脑胶质瘤中SHTN1与DNMT1的表达水平呈负相关;体外实验DNMT1敲减组中SHTN1的mRNA水平显著高于对照组[U251:敲减组SHTN1表达丰度高于对照组(1.692比1.000,P＜0.01);U87:敲减组SHTN1表达丰度高于对照组(1.420比1.002,P＜0.05)].BSAS测序验证SHTN1的3个CpG位点在DNMT1敲减组的甲基化水平下调(P＜0.05).结论 SHTN1的低表达可能与脑胶质瘤患者不良预后相关,DNMT1能通过DNA甲基化作用调控SHTN1的表达.

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)是导致老年人失明的主要原因之一,其特征为光感受器的死亡和视网膜色素上皮细胞的变性.该病的发病机制复杂,涉及遗传、环境和代谢等多种因素.细胞衰老是AMD的重要危险因素,表现为细胞在经历有限次数的分裂后进入永久性细胞周期停滞状态.随着年龄增长,衰老细胞的数量增加,并与多种年龄相关的慢性疾病密切相关.细胞衰老的潜在机制包括氧化应激、DNA损伤、线粒体功能障碍、自噬/线粒体自噬缺陷以及表观遗传改变等.在AMD中,色素上皮细胞、血管内皮细胞、Bruch膜、感光细胞和小胶质细胞等不同类型的细胞均表现出衰老及其相关变化.细胞衰老在AMD的发病机制中起着关键作用,涉及多种视网膜细胞类型和血管系统的退化.通过深入研究这些机制,期望能开发出更有效的治疗方法,以帮助患者恢复和保护视力.本文回顾了细胞衰老的生物学机制及其在AMD中的作用,深入探讨了不同细胞衰老引发AMD发病的具体机制,旨在为AMD的发病机制和治疗研究提供新思路.

放射治疗是针对不同类型实体肿瘤的有效抗肿瘤手段，超过50%的肿瘤患者会在病程的不同阶段接受放射治疗。传统的放射生物学研究认为，放射治疗主要是通过辐照引起肿瘤细胞DNA损伤而导致细胞发生增殖性死亡，从而达到杀灭肿瘤细胞的目的。但临床数据表明，不少患者在接受放射治疗后仍出现肿瘤复发及转移。目前有研究发现，放射后的肿瘤细胞可能出现上皮-间质转化、昼夜节律紊乱、衰老、肿瘤细胞干性增加等变化，影响细胞的生物学行为，如侵袭、迁移等改变，造成肿瘤的复发及转移。本文拟对放射后肿瘤细胞的此类变化及分子机制进行综述，探索放射后肿瘤细胞生物学行为变化的相关机制，为肿瘤复发转移的防治提供依据。