目的:评估异体脱钙骨基质作为鼻成形中线支架材料的可行性。方法:2018年1—6月，沈阳美莱医疗美容医院选择6例(男1例，女5例；年龄19～40岁，平均23.2岁)缺少足够鼻中隔软骨、耳软骨软弱、拒绝取双侧耳软骨、拒绝取肋软骨患者，以异体脱钙骨基质作为构建鼻成形的中线支架结构。鼻成形术后18个月随访。结果:6例患者在术后半个月对手术效果均满意。术后18个月，2例对手术效果满意；4例鼻尖突度下降，要求再次手术。再次手术术中无法解剖出完整的异体脱钙骨基质。异体脱钙骨基质剩余部分残渣。组织学发现，植入的骨基质呈碎块状，纤维断裂。骨基质碎片周边可见炎症细胞和多核巨细胞。骨基质内骨细胞消失。结论:商用异体脱钙骨基质不适合作为鼻成形手术的中线支架材料。

[目的]探讨脱细胞骨基质/磷酸钙/半水硫酸钙(ACBM/CPC/CSH)复合人工骨材料的生物相容性及成骨性能.[方法]物理混合法合成ACBM/CPC/CSH复合人工骨材料,制备材料浸提液,用于急性、亚急性毒理、热原和表皮刺激实验.材料肌肉埋植实验,第7、14和21 d取材组织病理学检查,观察肌肉炎症反应;第14 d取材行流式细胞检查,观察血液与组织CD4+、CD8+T淋巴细胞含量变化,CCK-8法检测细胞毒性.建立大鼠股骨髁骨缺损模型,分别植入ACBM/CPC/CSH骨材料组(材料组)、磷酸钙/半水硫酸钙(CPC/CSH)(对照组)和不植任何材料(空白组),观察成骨情况.[结果]浸提液未引起小鼠急性与亚急性毒理反应,体重变化差异无统计学意义(P＞0.05).热原实验体温正常.表皮注射实验72h内皮肤未出现红斑.肌肉埋植实验,第7d肌肉组织有轻微炎症反应,21 d炎症消失;第14d流式细胞学检查,材料组、对照组和空白组外周血CD4+[(9.6±1.8)vs(10.1±1.2)vs(10.7±1.4),P=0.470],CD8+[(9.5±1.1)vs(10.3±1.8)vs(10.5±1.7),P=0.249];脾脏 CD4+[(18.1±1.5)vs(17.2±7.3)vs(17.5±1.0),P=0.195],CD8+[(8.8±7.2)vs(7.7±7.6)vs(7.8±7.2),P=0.359]淋巴细胞含量差异无统计学意义(P＞0.05).X 线片与Micro-CT结果显示,各组骨缺损均有不同程度修复,ACBM/CPC/CSH骨材料修复效果最佳.[结论]ACBM/CPC/CSH复合人工骨材料具有良好的生物相容性和体内成骨性能,有利于不规则骨缺损的修补.

目的 制备一种可注射含钙骨基质(injectable calcium-containing bone matrix,ICBM),评价其骨修复效果,并分析用于临床治疗的可行性.方法 将甘油和明胶作为赋型剂,与其制备的含钙骨基质(calcium-containing bone matrix,CBM)粉进行混合,得到 ICBM;通过测定骨粉、赋型剂和 ICBM 的 pH 值、钙含量,以及赋型剂、ICBM 的注射推力情况,对 ICBM 进行初步表征;通过体外 L929 细胞增殖实验对 ICBM 进行体外生物相容性评价;在昆明小鼠和白化豚鼠体内分别植入 ICBM 评价其体内安全性;进一步用裸鼠进行体内骨诱导验证;最后采用兔股骨髁缺损模型进行体内骨缺损修复,评价 ICBM 的有效性.结果 骨粉 pH 值为 6.51±0.32、钙含量为(26.24±1.25)%;赋型剂 pH 值为 5.56±0.28,注射推注力为(1.23±0.16)N;ICBM pH 值为 6.44±0.47,钙含量为(5.32±0.73)%,注射推注力为(10.87±1.53)N.ICBM 组细胞相对增殖率为(104.25±3.39)%,细胞毒性为 0 级;ICBM 未对昆明小鼠产生急性全身毒性反应,也未引起白化豚鼠发生迟发型超敏反应;在体内骨诱导组织学观察发现 ICBM 组可见大量有明显成骨出现;在兔股骨髁缺损修复 8 周时,脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)组缺损修复面积为(12.91±2.27)%,ICBM 组为(15.68±2.25)%,两组缺损修复面积差异有统计学意义(P<0.05).结论 制备一种 ICBM,使 CBM 具有注射可操作性同时不影响其成骨诱导活性,不仅使用方便,安全性高,还具有较高的临床推广应用价值.

目的 物理混合制备脱细胞骨基质(ACBM)与磷酸钙/硫酸钙(CPC/CS)复合材料,以提升人工骨材料的可塑性并观察其理化特性.方法 选取健康牛股骨干骺端松质骨制备ACBM,以ACBM为主体填充磷酸钙/半水硫酸钙(CPC/CSH),制备复合人工骨支架.设置ACBM占复合材料总体质量的10%、20%和30%3组,分别测量各组力学性能(弹性模量和抗压强度),选取其中最优力学性能组,采用X射线衍射(XRD)分析仪、扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)、微量凯氏定氮法和液体置换法进一步分析其理化性能,并与同种异体骨和复合CPC/CSH进行力学性能比较.结果 ①ACBM不同占比复合材料中,20%ACBM复合人工骨材料具有最佳力学性能,能够承受最大应力923.81 N,最大变形4.92 mm,弹性模量(85.91±3.67)MPa,抗压强度(3.34±0.15)MPa,与其他两组相比差异具有统计学意义(P<0.001).XRD显示,复合人工骨材料固化后主要是羟基磷灰石(HA)、CS和二水硫酸钙(CSD)等可吸收物质.扫描和透射电镜观察显示,材料孔径为(496.56±153.37)μm,内部孔隙相互贯通,连通性较好,缺损填充度高.材料蛋白质含量极低.液体置换法测量,孔隙率为(80.7±5.1)%.②力学性能测试,20%ACBM骨材料力学性能优于同种异体骨组和CPC/CSH组,差异有统计学意义(P<0.001).结论 20%ACBM复合人工骨材料具有较高的力学性能和孔隙率,可塑性强.

目的 研究探讨日本大耳白兔脂肪干细胞与脱钙骨基质构筑的组织工程骨在长期玻璃化冻存后的活性和成骨能力,以及它们复苏后在兔桡骨骨缺损修复中的作用.方法 分离脂肪干细胞,将其扩增至第 3 代后接种于猪松质骨来源的脱钙骨基质,经过 1 周的成骨诱导,将建立的组织工程骨置于装有玻璃化冻存液的 2 ml 冻存管内,置液氮环境中冻存.在冻存 1 周和12 周时,取出组织工程骨,分别在复苏后的第 1、4、7 和 11 天,使用 Hochest33258法检测细胞数量.复苏后的第 1、4、7 天,使用碱性磷酸酶(ALP)检验试剂盒评估 ALP 的活性,并使用 RT-PCR 反应来确认骨钙素(OCN)基因的表达量.建立 16 只日本大耳白兔的 2 cm 的桡骨中段缺损模型,随机分成 4 组:未经冰冻的组织工程骨组、空白对照组、经过 12 周冻存组织工程骨组和单独材料组.12 周后进行 X 线观察、Micro-CT 评价和 HE 染色组织学观察.结果 经过 Hochest33258 测试,在冻存 1 周和 12 周之后,复苏后第 1 天的细胞数量分别达到了冻存前的 74.4%和 72.3%,第 4～7 天细胞数量达到最高峰,而第 7～11 天则进入了平台期.冻存 1 周或 12 周后,ALP 表达量出现了轻微的下降,但随后又开始回升.冻存 1 周、12 周复苏后第 1 天 OCN 表达量稍微降低,随后 OCN 表达量逐渐升高,第 4～7 天升高速率快.X 线结果显示,冻存 12 周组与新鲜组织工程骨组都有连续性骨组织形成.Micro-CT 结果显示,冻存组与新鲜组织工程骨组可见明显的骨质形成,连续性完整.冻存组与新鲜组织工程骨组在骨体积、骨小梁数量、骨密度上均无明显差异(P>0.05),但均明显高于对照组和单纯支架材料组(P<0.05).HE 染色结果显示,新鲜组织工程骨组和冻存 12 周组织工程骨组可见明显的连续的新生骨形成.结论 长期冻存后的组织工程骨仍能保持足够的细胞数量,仍具备成骨能力和修复兔桡骨骨缺损的能力.

背景:课题组前期研究已证实,慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2 基因转染兔骨髓间充质干细胞在表达持续时间上具有一定的优势.但慢病毒介导人骨形态发生蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞复合脱钙骨基质能否在体内促进骨缺损修复的问题有待探究.目的:观察兔股骨大段缺损中植入慢病毒介导人骨形态发生蛋白2转染骨髓间充质干细胞复合脱钙骨基质后的修复效果,探寻治疗股骨大段缺损的新途径.方法:选取48只新西兰大白兔,股骨中段截骨钢板内固定法制备兔左侧股骨大段缺损模型.造模成功后,随机分成A,B,C,D组,每组12只.A 组无修复材料植入,B,C,D组分别植入脱钙骨基质、脱钙骨基质/骨髓间充质干细胞、慢病毒载体介导人骨形态发生蛋白2/骨髓间充质干细胞/脱钙骨基质.造模后2,4,8 及12 周分别处死每组3只兔子,通过苏木精-伊红染色、生物力学分析,X射线检查评价股骨大段缺损修复的情况.结果与结论: ①X 射线示A,B,C,D组均有不同的骨痂修复形成,且Lane-Sandhu X射线评分A

目的 探讨创伤后骨缺损组织工程骨(TEB)移植后,组织工程骨募集宿主骨髓间充质干细胞(BMSCs)参与骨重建的机制. 方法 体内实验:取8周龄FVB/N小鼠,切除股骨干中部2 mm骨干和骨膜,制作大段骨缺损.缺损处分别植入脱钙骨基质(DBM)和TEB并固定,所有小鼠按随机数字表法分为DBM组(18只)和TEB组(18只).移植后24 h流式细胞术评价宿主BMSCs入血的数量,活体动物体内成像观察两组募集循环中小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs)到达损伤区域的能力,ELISA法比较两组外周血中基质细胞衍生因子-1(SDF-1)含量.体外实验:(1)迁移小室实验评估SDF-1(100 ng/ml)促进人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)迁移的能力,SDF-1/趋化因子受体4(CXCR4)通路通过选择性CXCR4拮抗剂普乐沙福(AMD3100)阻断,按处理因素分为对照组、SDF-1组和SDF-1+AMD3100组.(2)建立人脐静脉内皮细胞(hUVECs)、hBMSCs共培养体系并通过SDF-1刺激细胞,按共培养细胞和处理因素分为hBMSCs组、hBMSCs+hUVECs组和hBMSCs+ hUVECs(AMD3100预处理)组.迁移小室实验比较各组hBMSCs迁移数量,ELISA法检测共培养上清的肝细胞生长因子(HGF)水平.(3)对体外培养的hUVECs分别通过SDF-1刺激以及AMD3100拮抗SDF-1/CXCR4,按处理因素分为对照组、SDF-1组和SDF-1+AMD3100组,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)评价各组HGF表达. 结果 体内实验:骨缺损材料移植后24 h,TEB组外周血中间充质干细胞(MSCs)数量、SDF-1浓度与DBM组比较均有明显增高(P＜0.05),TEB组募集的术后注射进入循环的mBMSCs多于DBM组(P＜0.01).体外实验:(1)单种细胞迁移小室实验中,相比对照组和SDF-1+AMD3100组,SDF-1组显著增强hBMSCs迁移能力(P＜0.01).(2) hBMSCs和hUVECs共培养体系迁移小室实验中,与hBMSCs组、hBMSCs+hUVECs(AMD3100预处理)组比较,hBMSCs+ hUVEC组迁移细胞数量和HGF浓度均显著增多(P＜0.01),而hBMSCs组与hBMSCs+ hUVECs(AMD3100预处理)组比较差异无统计学意义(P＞0.05).(3) qRT-PCR显示,与对照组比较,SDF-1组HGF表达明显升高(P＜0.01).拮抗SDF-1/CXCR4后,SDF-1+AMD3100组HGF表达与SDF-1组比较显著降低(P＜0.05).结论 骨缺损TEB移植后可以显著提高体内趋化因子SDF-1水平,有效促进宿主MSCs的动员和循环中MSCs的募集.SDF-1不仅通过SDF-1/CXCR4直接促进hBMSCs的迁移,还可上调血管细胞HGF的表达和分泌,进一步放大SDF-1对hBMSCs的趋化作用.

背景:各种材料和组织工程骨研究已取得了重大进展,不同材料均展示出强大的骨缺损修复能力.目的:概述骨缺损修复材料的研究现状与进展.方法:应用计算机检索PubMed、PMC、中国生物医学文献数据库、中国知网、万方数据库检索2007年6月至2017年6月关于骨缺损修复材料方面的文献,以"biomaterials,bone repair materials,bone substitute,bone tissue engineering,bone defect,bone repair"为英文检索主题词,以"生物材料,骨修复材料,骨替代物,骨组织工程,骨缺损,骨修复"为中文检索主题词.排除无关和重复性研究,共保留66篇文献进行总结与归纳.结果与结论:目前主要的骨缺损修复材料包括自体骨、同种异体骨、异种骨、脱钙骨基质、生物陶瓷、金属材料、高分子材料、组织工程骨及相关衍生的复合材料.不同材料均存在一定的优缺点,因此在临床应用时需结合材料特性做出优化选择.虽然骨缺损修复材料的相关研究已取得了重大进展,但如何实现材料的高度仿生,优化细胞的黏附及迁徙,精确调控相关基因和生长因子的表达和释放,验证临床应用的安全性及循证医学的证据支持等,仍然是学者们未来需要继续深入研究和解决的问题.

目的 探索松质骨骨基质明胶(bonematrixgelatin,BMG)作为组织工程软骨载体的可行性和有效性.方法 取新西兰白兔肱骨,通过脱脂、去矿化和去蛋白质多糖制备松质骨BMG.将分离的兔软骨细胞接种到松质骨BMG上,1、4、7 w后收获细胞BMG构建体,通过苏木精和伊红染色评价整体形态,甲苯胺蓝细胞外基质(ECM)蛋白聚糖,免疫组化染色胶原型Ⅱ和扫描电子显微镜观察BMG上的细胞微结构.结果 制备的BMG是高度多孔的,并且容易修剪各种形状用于组织修复.培养时间为1、4、7 w,新形成的软骨组织百分比分别为(11.43 ± 2.16)%、(27.41 ± 4.42)%和(44.89 ± 6.05)%,差异有统计学意义(P ＜0.05);Ⅱ型胶原蛋白的平均灰度值分别为153.62 ± 6.37、135.49 ± 7.05和120.18 ± 5.34,差异有统计学意义(P ＜0.05);蛋白聚糖的平均灰度值分别为144.69 ± 4.05、120.37 ± 2.85、101.96 ± 3.52,差异有统计学意义(P ＜0.05).结论 松质骨BMG具有良好的生物相容性,可控的机械强度和降解速率,显著的低免疫原性,高可用性和合适的孔隙率.

背景:相对于其他用于支架材料的高分子化合物,脱软骨细胞基质能够模拟出更接近原生理状态下的细胞外环境,由其制备的椎间盘支架弹性模量也更加接近软骨组织.目的:制备脱细胞软骨基质,并从细胞和活体两方面评价其生物相容性.方法:将猪软骨粉碎后,经胰酶、核酶及TritonX-100处理得到脱细胞软骨基质.①细胞毒性实验:将脱细胞基质溶于醋酸,制备成脱细胞基质膜.将SD大鼠腰椎终板软骨干细胞接种于脱细胞基质膜上,培养1-5 d,采用CCK-8检测软骨干细胞在基质膜上的增殖情况,评价细胞毒性分级;②动物体内毒性实验:将含有脱细胞基质的醋酸(实验组)与醋酸(对照组)分别注射至SD大鼠背部皮下,形成皮丘,注射后36 h内观察大鼠体温与皮丘直径变化.结果与结论:①细胞毒性实验:倒置显微镜下可见,腰椎终板软骨干细胞接种于脱细胞基质膜2 d即贴壁,呈梭形生长,接种5 d内的细胞相对增殖率均在80%以上,细胞毒性分级为0至1级;②动物体内毒性实验:注射后即刻,两组大鼠背部均可见皮丘形成,注射36 h内皮丘内溶液被完全吸收,并且对照组吸收速度快于实验组,两组皮丘边缘均无红肿现象;注射36 h内,实验组与对照组大鼠体温均未超过37.5℃;③结果表明:脱细胞软骨基质具有很好的生物相容性,符合生物支架选材标准.