卵巢组织冻存与移植技术不仅保护女性生育力,还可保存卵巢内分泌功能,有效防治医源性早发性卵巢功能不全,尤其适用于青春期前女童与亟需原发病治疗的女性.卵巢组织冻存的有效性与安全性已得到了广泛验证,目前的临床金标准为慢速冻存,而玻璃化冻存仅适用于研究.尽管该技术近年来发展迅速,但仍面临超低温冻存损伤、冷冻保护剂毒性、卵泡储备量的评估、冻存与移植的安全性等问题.本文针对以上问题的研究进展进行综述.

背景:冻存能够较好地保证血管结构的完整性,如何改善移植后排斥反应的问题受到越来越多的关注.目的:综述不同冷冻技术降低同种异体血管移植排斥反应的研究进展,以期为临床研究提供参考.方法:系统检索中英文数据库CNKI、万方和PubMed以及在线网站Baidu和Google Scholar自建库以来发表的降低同种异体血管移植排斥反应的相关文献.中文检索关键词:心血管疾病、内皮细胞、低温冻存、血管移植、免疫原性、排斥反应,同种异体移植和冷冻保护剂;英文检索关键词:cardiovascular disease、endothelial cells、cryopreservation、blood vessel transplantation or vascular graft、Immunogenicity、immune rejection、allograft or allogeneic transplantation or allograft transplantation and cryoprotectant.按照纳入排除标准共选取68篇文献进行综述.结果与结论:①综述发现通过改进现有冷冻技术能够降低同种异体血管移植排斥反应,其中主要涉及冻融方式和冻存保护剂的选择.②现有研究提示冻干法优于低温冻存,但限于条件未能广泛开展,现仍以低温冻存为主,其中玻璃化冻存、缓慢复温和使用不锈钢乃至含银材料效果优于程序式冻存及快速复温.③渗透性和非渗透性冻存保护剂的联合选择,可以在降低其毒性的同时,进一步减少排斥反应的发生.

目的 研究探讨日本大耳白兔脂肪干细胞与脱钙骨基质构筑的组织工程骨在长期玻璃化冻存后的活性和成骨能力,以及它们复苏后在兔桡骨骨缺损修复中的作用.方法 分离脂肪干细胞,将其扩增至第 3 代后接种于猪松质骨来源的脱钙骨基质,经过 1 周的成骨诱导,将建立的组织工程骨置于装有玻璃化冻存液的 2 ml 冻存管内,置液氮环境中冻存.在冻存 1 周和12 周时,取出组织工程骨,分别在复苏后的第 1、4、7 和 11 天,使用 Hochest33258法检测细胞数量.复苏后的第 1、4、7 天,使用碱性磷酸酶(ALP)检验试剂盒评估 ALP 的活性,并使用 RT-PCR 反应来确认骨钙素(OCN)基因的表达量.建立 16 只日本大耳白兔的 2 cm 的桡骨中段缺损模型,随机分成 4 组:未经冰冻的组织工程骨组、空白对照组、经过 12 周冻存组织工程骨组和单独材料组.12 周后进行 X 线观察、Micro-CT 评价和 HE 染色组织学观察.结果 经过 Hochest33258 测试,在冻存 1 周和 12 周之后,复苏后第 1 天的细胞数量分别达到了冻存前的 74.4%和 72.3%,第 4～7 天细胞数量达到最高峰,而第 7～11 天则进入了平台期.冻存 1 周或 12 周后,ALP 表达量出现了轻微的下降,但随后又开始回升.冻存 1 周、12 周复苏后第 1 天 OCN 表达量稍微降低,随后 OCN 表达量逐渐升高,第 4～7 天升高速率快.X 线结果显示,冻存 12 周组与新鲜组织工程骨组都有连续性骨组织形成.Micro-CT 结果显示,冻存组与新鲜组织工程骨组可见明显的骨质形成,连续性完整.冻存组与新鲜组织工程骨组在骨体积、骨小梁数量、骨密度上均无明显差异(P>0.05),但均明显高于对照组和单纯支架材料组(P<0.05).HE 染色结果显示,新鲜组织工程骨组和冻存 12 周组织工程骨组可见明显的连续的新生骨形成.结论 长期冻存后的组织工程骨仍能保持足够的细胞数量,仍具备成骨能力和修复兔桡骨骨缺损的能力.

背景:玻璃化冻存是一种新型的低温保存技术,在临床活肿瘤组织样本库的建设中具有潜在的应用价值.目的:探讨新型玻璃化冻存技术的有效性以及在活肿瘤穿刺组织样本库建设中的可行性.方法:将新鲜直肠癌肝转移活检组织样本随机分为2组,实验组作玻璃化冻存处理,对照组不作处理.取部分复苏后活检组织和部分新鲜活检组织分别接种于小鼠背部皮下,建立人源化移植瘤模型.对比观察活检肿瘤组织冻存前后生物学活性和组织学特征的变化.Calcein-AM活细胞染色和Hoechst33342染色反映细胞活性变化,Ki67标记免疫组织化学及苏木精-伊红染色反映组织的增殖能力和形态学特征变化.初步收集105例直肠癌肝转移活检组织并作玻璃化冻存,建立活性肿瘤穿刺组织生物样本库.结果与结论:直肠癌肝转移活检组织在玻璃化冻存前后未发生显著的生物学活性和形态学特征改变(P >0.05),说明新型玻璃化冻存技术可有效冻存活性穿刺肿瘤组织,并对生物样本库的建设具有实际应用价值.

该研究通过对脱水时间和化冻温度的探索,检验了包埋玻璃化法在超低温保存湿润生境中苔藓的可能性.结果表明:卵叶泥炭藓无菌苗在4℃条件下预培养3d后,在0℃用60％ PVS2装载30 min,PVS2脱水60 min后迅速投入液氮保存,24 h后用40℃水浴快速化冻2 min再培养,成活率可达42.41％,且再生植株与常温状态下的植株形态指标没有显著性差异.研究认为,包埋玻璃化法超低温保存湿润环境中生长的苔藓植物是可行的.

目的 分析卵裂期胚胎和囊胚期胚胎重复冷冻复苏后的种植潜能及移植后的临床结局. 方法 回顾性分析2013 年 1 月至 2017 年 9 月在本科室复苏玻璃化冷冻胚胎后取消移植,胚胎经重复冻融后再次解冻周期 57 个.排除混合移植单次冻融胚胎的周期后,最终收集完全移植重复冻融胚胎周期数37 个,采用倾向性评分匹配法从同时期移植单次冻融胚胎的患者中匹配出59 个卵裂期胚胎移植周期和39 个囊胚移植周期作为对照组,分析重复冷冻胚胎复苏后的存活率及移植后的种植率、生化妊娠率、临床妊娠率、异位妊娠率、早期流产率、活胎分娩率等临床指标. 结果 重复冷冻卵裂期胚胎复苏存活率为 96.49%(55/57),重复冷冻囊胚复苏存活率为 95.83%(23/24),移植后种植率、HCG 阳性率、临床妊娠率、异位妊娠率、早期流产率、活胎分娩率等临床结局与对照组单次冻融胚胎移植后的结局相比无统计学差异(P＞0.05 ). 结论 重复冻融胚胎移植后的临床结局与匹配条件下的单次冻融胚胎的临床结局无显著性差异.重复冷冻可以认为是一种安全的复苏周期取消移植后胚胎处理方式.

目的:观察小鼠卵巢组织促卵泡刺激素(FSH)在小鼠卵巢组织玻璃化冻存过程中的抗凋亡作用.方法:将4周龄C57BL/6J雌性小鼠卵巢组织,分为新鲜对照组(CG)、玻璃化冻存对照组(VCG)、0.3 IU/ml FSH全程干预玻璃化冻存组(OG-FSH),玻璃化冻存条件为小鼠卵巢入培养液在37℃二氧化碳培养箱培养60 min,接着入1.5 mol/L乙二醇中预渗透平衡8 min,再移入EG5.5-30玻璃化液渗透平衡3.5 min,之后投入-196℃的液氮罐中保存1 d,全过程在22～24℃下进行.每组20枚卵巢,10枚进行HE染色后的正常卵泡百分比计数,10枚进行免疫组织化学法观察.结果:与对照组(CG)比较,玻璃化冻存对照组(VCG)正常卵泡百分比显著降低,active caspase-3的表达量显著升高(P<0.05);与玻璃化冻存对照组(VCG)比较,0.3 IU/ml FSH全程干预玻璃化冻存组(OG-FSH)组的正常卵泡百分比明显升高,active caspase-3的表达量显著降低(P<0.05).结论:小鼠卵巢玻璃化冻存全程添加FSH干预可有效抵抗凋亡执行蛋白active caspase-3的表达,有利于卵巢组织形态结构的保护.

目的 通过在玻璃化冻存的不同时段给予小鼠卵巢组织重组人卵泡刺激素(recombinant follicle-stimu-lating hormone,rFSH)与重组人黄体生成素(recombinant luteinizing hormone,rLH)共同干预,观察对冻融小鼠卵巢组织的形态学、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及缝隙连接蛋白(connexin-37,Cx37)表达的影响.方法 将4周龄C57BL/6J小鼠卵巢组织随机分为新鲜对照组(FCG)、玻璃化冻存对照组(VCG)、冻存全程添加rFSH+rLH组(OG-rFSH+rLH)、冻存前添加rFSH+rLH组(BG-rFSH+rLH)以及冻存后添加rFSH+rLH组(AG-rFSH+rLH),干预组浓度均为0.15IU·mL-1 rFSH+0.15IU·mL-1 rLH.通过形态学、 免疫组织化学技术观察并分析各组卵巢组织形态结构及VEGF、Cx37蛋白表达量的改变;通过Real-time PCR技术检测并分析各组VEGF及Cx37 mRNA的表达变化.结果 正常卵泡百分比在VCG组最低,OG-rFSH+rLH组最高(P<0.05),在BG-rFSH+rLH组低于OG-rFSH+rLH组,高于FCG组、VCG组及AG-rFSH+rLH组(P<均0.05);干预组VEGF蛋白表达量由高到低依次为OG-rFSH+rLH组、BG-rFSH+rLH组、AG-rFSH+rLH组,且均高于VCG组(P<0.05);Cx37蛋白表达量及VEGF mRNA表达量均为OG-rFSH+rLH组最高,VCG组最低(P<0.05);Cx37 mRNA表达量在OG-rFSH+rLH组最高,VCG组最低,FCG组高于VCG组,低于BG-rFSH+rLH组和AG-rFSH+rLH组(P均<0.05).结论 玻璃化冻存过程添加rFSH+rLH的干预模式提升卵泡存活率、VEGF、Cx37蛋白及mRNA的表达,最佳干预效果依次为全程干预、冻存前时段干预及冻存后时段干预.

目的 采用三种浓度冷冻保护剂方案对两周龄未成熟大鼠睾丸组织进行玻璃化冻存,并对冻存效果做出评价.方法 根据DMEM/F12培养基中所含二甲基亚砜(DMSO)和乙二醇(EG)的浓度差异,将冻存液分为A、B、C三组,其中DMSO和EG的浓度依次为7.5％、15％、25％.将大鼠睾丸分割为8 mm3～9 mm3大小的组织块,分别纳入对照组、A组、B组和C组中.对照组的睾丸组织不作冷冻处理,直接进行后续实验;A、B、C三组使用不同浓度的冷冻保护剂进行玻璃化冷冻.冻存2周后,取出样本进行复苏.比较各组睾丸组织的形态学改变,采用免疫荧光染色观察精原细胞标志物UCHL1、支持细胞标志物SOX9、睾丸间质Leydig细胞标志物StAR和细胞增殖核抗原PCNA表达的改变,观察细胞的凋亡情况. 结果 玻璃化冻存后,未成熟大鼠睾丸组织形态发生一定程度改变,生精细胞及支持细胞标志物表达下降,凋亡增加,与对照组比较均有显著性差异(P＜0.05).三个冻存组中,B组形态学改变最小,细胞标志物表达水平与对照组相差最少,凋亡最少;A组的结构损伤明显,生精上皮与基底膜分离;C组的细胞标志物表达显著下降,凋亡增加最显著. 结论 冷冻保护剂浓度变化对未成熟睾丸组织玻璃化冻存效果有显著影响,15％ DMSO和15％EG组合是玻璃化冻存未成熟大鼠睾丸组织较适宜的冷冻保护剂浓度方案,可为进一步的临床应用提供参考.

玻璃化法冻存是一种在冻存过程中使细胞内外溶液形成"玻璃化"状态的冻存技术.与传统程序化冻存法相比,玻璃化法冻存操作简单、费用低廉且可避免胞内冰晶的形成,在组织样本低温冻存中具有明显的优势,目前已成为多数专家学者的研究重点.作者对玻璃化法冻存的原理、细胞损伤机制、玻璃化法冻存效果的影响因素及其评价指标等进行综述,为后续研究提供参考.