目的 探讨围绕福尔马林固定石蜡包埋(formalin fixed paraffin embedded,FFPE)样本特性获取更高质量/得率的纳米磁珠核酸提取方案,改进分子病理技术.方法 合成4大类15个小类的备选磁珠,以FFPE样本为中心,筛选高质量/得率磁珠.模拟常规组织、粗针穿刺(肝脏)、纤维支气管镜样本(肺),装管相同张数连片.采用筛选的最佳磁珠与市场出售的常见磁珠试剂提取核酸,横向对比纯化总量、片段大小等质量参数.应用PCR和Sanger验证核酸的下游应用.结果 以FFPE样本DNA为中心筛选自制纳米磁珠,获得最佳性能纳米磁珠总回收率为58.5％±1.58％,5种市售商品化磁珠和3种国产磁珠总回收率为18.68％～40.71％.相同组织量(连片)提取的DNA总量,在模拟常规组织、粗针穿刺和纤维支气管镜样本核酸得率比市售试剂盒提高39.49％～181.72％(P＜0.05).模拟纤维支气管镜样本1张(4 μm)总量可达100 ng以上、5张总量可达400 ng以上.结论 以FFPE样本DNA为中心筛选的DNA纯化纳米磁珠,与商品化磁珠相比有较大提升,为临床分子病理检测的质量保证、自动化检测和项目拓展提供空间.

目的:优化肠道菌群核酸提取自动化流程.方法:收集粪便样本,分别采用手工方法、核酸提取工作站提取核酸,然后利用液体工作站制备PCR反应液进行PCR扩增,最后采用文库工作站建库测序.结果:400μl样品用QIAamp(R) Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒裂解液裂解后,用MagMAXTM Express 96机器提取核酸的方法与用QIAamp(R) Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒手工提取核酸的方法相比,测序得到的序列数基本一致,分析结果也没有明显区别;而单独采用MagMAXTMViral RNA Isolation Kit试剂盒提取核酸由于样品投入体积受限(50μl)、核酸浓度低、测序得到的序列数太少,不能满足后续的分析要求.结论:通过结合使用两种不同的试剂盒,可以实现核酸提取、PCR反应液配制及文库制备的全流程自动化操作,从而大大提高工作效率和结果的稳定性.

目的 评价并比较用于检测血浆EBV-DNA的3种核酸提取方法的分析性能及临床应用价值.方法 分别采用硅膜离心柱法、浓缩煮沸裂解法或自动化磁珠吸附法平行提取核酸,并通过实时荧光定量PCR测定EBV-DNA.利用第三方定值参考物质,比较三种方法的检测性能,并配对检测100例NPC患者及100名健康体检者血浆,评估3种方法的临床应用价值.结果 3种方法提取并检测EBV-DNA的正确度、不精密度均符合要求,且对临床样本的测定结果均呈线性相关.但磁珠法的重复性不精密度和中间不精密度较离心柱法与煮沸法均小且稳定(均<3％);最低检测限(约3.334×101 IU/ml)较离心柱法(4.159×101 IU/ml)与煮沸法(8.511×101 IU/ml)稍灵敏;线性范围(5.4×101～5.4×105 IU/ml)较煮沸法(5.4×102～5.4×105 IU/ml)稍宽;抗Hb干扰能力优于煮沸法;而且对NPC样本检测的阳性率及平均病毒载量(95％,8.342×103 IU/ml)均显著高于离心柱法(84％,4.707×103 IU/ml)与煮沸法(78％,2.571×103 IU/ml)(P均<0.05).结论 采用自动化磁珠吸附法提取检测血浆EBV-DNA可以实现更好的检测性能,并具备更高的临床应用价值.

目的 评价一种新的核酸自动化提取方法在病原体检测中的应用.方法 分别用试剂盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit)和核酸自动提取仪Genolution NX-48平行提取同一批104份临床咽拭子样本,利用商业化的RespiFinder SMART22多重荧光PCR检测试剂盒和甲型流感病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒,比较两种核酸提取方法对不同病原体检出率及甲型流感病毒最低检测限的影响.结果 临床咽拭子样本经两种方法提取核酸后用于呼吸道多病原检测,结果具有高度一致性(Kappa＞0.60).可检出19种呼吸道病原,包括DNA病毒、RNA病毒及非病毒病原,其中检出率较高的病原为鼻病毒/肠道病毒(rhinovirus/enterovirus,Rhino/Entero)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、甲型流感(influenza A,InfA)病毒及腺病毒(adenovirus,Adeno).QIAamp Viral RNA Mini Kit及核酸自动提取仪Genolution NX-48提取的甲型流感病毒的最低检测限为1.36×100和1.41×101PFU/mL,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 核酸自动提取仪Genolution NX-48应用性能良好,提取核酸省时、快捷、成本低,结合RespiFinder SMART22多重荧光PCR检测试剂盒,可进行临床和实验室大量样本的核酸快速提取及呼吸道多病原检测.

目的:对乙肝病毒DNA(HBV-DNA)检测的2种不同核酸提取方法,即手工法(煮沸法)和全自动核酸提取仪法(磁珠法),在使用相同的检测试剂和核酸扩增仪的条件下进行性能验证,以评价其验证结果.方法:依据《医学实验室质量和能力认可准则》《全国临床检验操作规程》等相关文件,由同一操作人员应用中山达安公司生产的HBV-DNA检测试剂盒和ABI7500实时荧光核酸扩增仪,分别采用手工法和全自动核酸提取仪法提取HBV-DNA进行临床样本的批内精密度、批间精密度、正确度、线性范围性能验证实验.结果:手工法的高值血清批内精密度为2.18％,低值血清批内精密度为3.76％;高值质控品批间精密度为3.29％.全自动核酸提取仪法的高值血清批内精密度为1.78％,低值血清批内精密度为2.44％;高值质控品批间精密度为2.84％.正确度验证分别取浓度为2.0×103、2.0×104、2.0×105、2.0×106copies/ml的可溯源标准品进行验证,手工法偏倚分别为-4.88％、-2.51％、-2.46％,-2.12％,全自动核酸提取仪法偏倚分别为-2.37％、-0.95％、0.74％、-1.33％.线性范围验证中,手工法和全自动核酸提取仪法的相关系数分别为0.9660、0.985 8,均能满足临床检测的需求.结论:全自动核酸提取仪法较手工法提取核酸有利于简化HBV-DNA提取流程,实现分子生物实验室自动化提取核酸.

病原微生物的快速检测对疫情的预防控制至关重要.基于PCR的病原微生物核酸检测方法克服了传统病原微生物培养方法耗时长、免疫学检测存在窗口期等问题,已成为目前最主要的病原微生物筛查方法.然而,对精确控温热循环仪的依赖却严重限制了其在资源匮乏地区的应用.虽然基于核酸等温扩增的病原微生物检测方法可摆脱对高精度温控设备的依赖,但仍需要进行样本核酸分离提取、扩增与检测等步骤.近年来,微流控技术与核酸等温扩增技术相结合,诞生了多种病原微生物等温扩增微流控检测技术.该技术通过设计芯片结构、优化进样模式及检测方式,实现了病原微生物核酸提取、扩增与检测一体化,并具备多重检测、定量检测等功能,具有对仪器依赖度小、对操作人员要求不高、样本量需求小和自动化程度高等优点,适合于在多种环境下的病原微生物快速检测.本文从核酸等温扩增原理、进样方式、检测方式等方面对核酸等温扩增病原微生物微流控检测技术进行了综述,以期为病原微生物的快速筛查提供更多的方案思路,提升公共卫生领域对传染性疾病的防控能力.

目的:建立毛细管电泳-激光诱导荧光(CE-LIF)检测方法,对重组人1型单纯疱疹病毒(rHSV-1)的DNA限制性酶切片段进行分析.方法:以rHSV-1为研究对象,用核酸提取仪提取其DNA,以DNA限制性内切酶Nde Ⅰ酶切,以SYBRTM Gold nucleic acid作为荧光标记物,利用CE-LIF实现分离检测,通过DNA ladder计算片段大小.CE-LIF条件:采用涂层毛细管(有效长度30 cm,总长度40 cm,内径100 μm),3.45 kPa压力进样3s;毛细管分离温度设为25℃,毛细管分离电压为-7 kV,分离时间40 min;LIF检测器的激发波长及发射波长分别为488 nm和520 nm.结果:新建方法可以对8个目标酶切片段分离检测,各片段峰迁移时间的RSD(n=6)均小于0.35％,片段峰1～7校正峰面积百分比的RSD(n=6)均小于5.6％,方法精密度良好.通过DNA ladder回归方程,对DNA酶切产物进行片段大小的计算,各片段大小计算结果RSD(n=6)均小于5.8％,且与琼脂糖凝胶电泳法测得结果相一致.结论:本研究建立的rHSV-1的DNA限制酶酶切片段CE-LIF分析法自动化程度高,灵敏度高,重复性好,试剂消耗及环境污染小,适用于rHSV-1的鉴别分析.

目的:评价一种国产核酸磁珠自动提取系统对人巨细胞病毒(HCMV) DNA检测的性能.方法:采用科华磁珠核酸自动提取仪提取血浆HCMV DNA,经实时荧光定量PCR检测,分析其线性范围、灵敏度、精密度及抗干扰能力、8混养模式的检测效能.并利用30份含HCMV感染患者及20份健康人群血浆对该方法进行临床应用评价,其检测结果与沉淀离心提取法进行比较.结果:该方法检测HCMV DNA载量的线性范围为102～106 copy/mL.检测灵敏度为100 copy/mL(单检).测定值与理论值的相关性良好,R2=0.998,P＜0.01.批内和批间变异系数(CV)均小于5％.临床应用评价发现,国产磁珠核酸自动提取法与沉淀离心提取法对临床样品的检测一致性较好(Kappa=0.839≥0.75,P＜0.01),磁珠自动提取法的阳性率高于沉淀离心提取法(100％ vs 86.7％),但差异无统计学意义(P=0.125).在102～103 copy/mL范围内,国产磁珠核酸自动提取发现优于沉淀离心法.2法所获得的定量结果差异有统计学意义(P＜0.05).8混养模式的检测灵敏度为103 cop-y/mL,拆分结果与实际相符,未产生交叉污染.结论:基于国产磁珠自动核酸提取系统实现了快速、自动化提取HCMV DNA,具有良好检测性能,适用于采供血机构HCMV的血液核酸检测及临床应用推广.

常规聚合酶链式反应对反应条件的要求很高,需要在多个温度下进行循环,而核酸等温扩增仅需在恒定温度下就能进行核酸的高效快速扩增.离心式微流控芯片技术具有微型化、集成化、高通量、自动化等优势,可实现实时、低成本生化检测分析.本文介绍了离心微流控芯片技术在核酸扩增前处理和核酸等温扩增中的应用,主要包括核酸提取、试剂预存储和核酸等温扩增等方面,并且对离心微流控芯片技术用于核酸等温扩增中存在的问题与未来的发展方向进行分析讨论.

目的 建立高通量、半自动化细菌全基因组序列测定体系,满足基于基因组序列的细菌性病原体监测的需求.方法 使用自动化液体处理器、可丢弃性机械手枪头、96孔板型核酸提取试剂盒、自动测序文库构建系统以及测序仪,实现细菌基因组序列测定的半自动化.结果 机械手枪头与加样孔底的距离、液体混合速度和每次混匀液体的体积比3个因素与样品之间的交叉污染密切相关,机械手枪头与加样孔底的距离为2mm、液体混合速度为全速的15％、每次混匀液体的体积比为50％时污染率为0.与手工方法相比,高通量半自动化细菌全基因组序列测定体系的工作效率提高了4倍.结论 建立的高通量、半自动化细菌基因组序列测定体系,能够满足基于基因组序列的细菌性病原体监测的需求.