目的:探讨黄芪甲苷对人内皮祖细胞(EPC)分泌外泌体及外泌体中微小RNA-126(miRNA-126)表达的影响。方法:取湖南中医药大学第一附属医院妇产科2019年出生的1名足月健康新生儿脐带血，采用密度梯度离心法分离单个核细胞并培养7 d，其间行形态学观察；取第3代细胞，采用CD31免疫磁珠分选法和双荧光染色法鉴定。将鉴定成功的EPC按照随机数字表法分为黄芪甲苷组和磷酸盐缓冲液(PBS)组。黄芪甲苷组细胞加入终质量浓度100 mg/L的黄芪甲苷培养24 h，PBS组细胞加入等体积的PBS培养24 h。培养结束后收集2组细胞培养上清液中的外泌体，采用蛋白质印迹法检测外泌体特征性标志物CD9、CD63和CD81表达，于透射电子显微镜下观察EPC外泌体(EPC-Exo)形态，采用纳米颗粒跟踪分析技术检测EPC-Exo的粒径，采用二辛丁酸法测定EPC-Exo的浓度(样本数为3)，采用反转录PCR法测定EPC-Exo中与血管新生相关miRNA-126-3p和miRNA-126-5p的表达(样本数为3)。对数据行独立样本 t检验。 结果:(1)培养第4天，细胞开始贴壁生长，圆形、梭形、条形等多形态同时出现；继续培养至第7天时，细胞边缘清晰，呈铺路石样排列，中央细胞呈圆形，周边细胞呈梭形。(2)CD31免疫磁珠分选法显示细胞膜染绿色，细胞核染蓝色；双荧光染色法显示细胞呈橙黄色。经以上鉴定，细胞被证实为EPC。(3)培养24 h，2组EPC-Exo的CD9、CD63和CD81表达均呈阳性，证实本实验已成功提取EPC-Exo。(4)培养24 h，2组EPC-Exo均呈圆形膜囊泡，形态无明显差异。(5)培养24 h，黄芪甲苷组中98.7%的EPC-Exo粒径为84.7～143.1 nm，PBS组中98.0%的EPC-Exo粒径为88.7～123.5 nm。(6)培养24 h，黄芪甲苷组EPC-Exo的质量浓度为(310±5)μg/mL，明显高于PBS组的(257±5)μg/mL， t＝13.369， P<0.01。(7)培养24 h，黄芪甲苷组EPC-Exo中miRNA-126-3p( t＝16.062， P<0.01)和miRNA-126-5p( t＝3.252， P<0.05)均明显多于PBS组。 结论:黄芪甲苷可改善人EPC分泌外泌体的功能，且所分泌的外泌体负载miRNA-126。

目的:筛选血管炎性标志物脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）的DNA适体，并建立以非标记核酸适体-纳米金为探针的可视化检测方法。方法:方法学建立。通过磁珠固定SELEX技术经孵育结合、ssDNA分离、PCR扩增、单链回收的8轮循环筛选Lp-PLA2适体，利用表面等离子体共振技术和流式细胞术验证适体的亲和力和特异性，并通过计算机软件模拟适体二级结构及其与靶蛋白的三维分子对接。随后制备适体-纳米金复合物，利用靶标竞争结合导致纳米金溶液在盐诱导下凝聚引起颜色变化，分光光度计检测溶液的吸光度检测靶标浓度，建立样品溶液中Lp-PLA2浓度与吸光度的线性关系。结果:筛选获得3条高亲和力、强特异性的Lp-PLA2核酸适体B76-2、B76-4及B76-5，解离常数分别为1.07、1.26及1.75 nmol/L；并成功基于B76-2适体构建纳米金比色传感方法，其线性范围和检测限分别是20~500 ng/ml和78 ng/ml，反应时间30 min，可特异性区分靶标与其他血栓标志物如凝血酶和髓过氧化物酶。结论:利用核酸适体-纳米金显色实现了简单、快速、特异的Lp-PLA2可视化检测。

外周血循环肿瘤细胞作为一种生物标志物，在癌症的早期筛查、早期诊断、预后评估和疗效检测等过程中都有重要的临床意义，探索高效准确的循环肿瘤细胞分离技术迫在眉睫。纳米技术被认为是目前最有前景的分离循环肿瘤细胞的技术。近10年涌现大量应用纳米技术进行循环肿瘤细胞分离的研究，除了Cell-Search?系统的纳米磁珠免疫富集技术，目前微流控芯片、纳米纤维等也是发展应用的热门以期开发出更加有效的循环细胞分离及检测技术。

目的:探讨脓毒症患者循环外泌体（EXO）对T细胞功能的影响。方法:用超速离心法获取南方医科大学附属广东省人民医院急诊重症监护室收治的10例脓毒症患者血浆EXO后，利用透射电镜观察、纳米粒子跟踪分析（NTA）和蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测EXO标志物鉴定EXO的特征。从5名健康志愿者外周血中分离出外周血单个核细胞（PBMC），使用磁珠分选原代T细胞并体外扩增。用不同剂量（0、1、2.5、5、10 mg/L）脓毒症患者循环EXO干预T细胞24 h后，使用细胞增殖与毒性检测试剂盒（CCK-8）检测T细胞活性，流式细胞术检测T细胞活化指标CD69和CD25的表达，进一步评估CD4 + T细胞程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）表达和调节性T细胞（Treg）比例等免疫抑制指标。 结果:鉴定结果证实成功从脓毒症患者血浆中提取出EXO，脓毒症患者循环EXO含量明显高于健康对照组（mg/L：48.78±5.14比22.18±2.25， P<0.01）。5 mg/L脓毒症患者血浆EXO干预原代T细胞24 h后，T细胞活性开始出现抑制〔（85.84±0.56）%比（100.00±0.00）%， P<0.05〕；随着剂量增加，10 mg/L EXO干预T细胞24 h后，细胞活性被明显抑制〔（72.44±2.36）%比（100.00±0.00）%， P<0.01〕。与健康对照组相比，脓毒症患者血浆EXO干预T细胞后，早期活化指标CD69表达显著减少〔（52.87±1.29）%比（67.13±3.56）%， P<0.05〕，同时伴随着T细胞中PD-1表达上调〔（57.73±3.06）%比（32.07±0.22）%， P<0.01〕和Treg比例增加〔（54.67±1.19）%比（24.60±3.51）%， P<0.01〕，但晚期活化指标CD25表达保持稳定〔（84.77±3.44）%比（85.93±2.32）%， P>0.05〕。 结论:脓毒症患者循环EXO引起T细胞功能障碍，其可能是导致脓毒症免疫抑制的新机制。

目的:研究Fe 3O 4纳米酶对白念珠菌的抗菌作用。 方法:改进水热合成法，制备Fe 3O 4纳米酶。以0.5 g/L Fe 3O 4纳米酶和0.1% H 2O 2与菌液共培养，分为纳米酶组、H 2O 2组、联合组（纳米酶+ H 2O 2共处理），以未做处理菌液为对照组。4组菌液以沙氏液体培养基培养，每隔2 h检测600 nm处吸光度（ A值），观察白念珠菌生长情况。取4组菌液共处理2 h，扫描电镜观察各组白念珠菌形态；涂板后，于36 ℃培养48 h，观察菌落形成情况并计数，计算抑菌率。多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD- t检验。 结果:对照组白念珠菌具有相对稳定的生存曲线，而纳米酶组、H 2O 2组、联合组白念珠菌的生长均受到抑制。4组菌落计数分别为124 830 ± 45 170、86 330 ± 13 960、91 670 ± 31 370、30 330 ± 3010，差异有统计学意义（ F = 9.41， P < 0.05），联合组低于对照组（ t = 4.63， P < 0.05）。H 2O 2组、纳米酶组、联合组抑菌率分别为30.84% ± 5.00%、26.57% ± 11.24%、75.70% ± 2.42%，差异有统计学意义（ F = 9.413， P < 0.01），联合组高于H 2O 2组、纳米酶组（ t = 8.08、4.27， P < 0.01），差异均有统计学意义。扫描电镜观察，经过处理后菌体形态发生皱缩、破裂甚至崩解等改变。 结论:Fe 3O 4纳米酶联合H 2O 2对白念珠菌抑菌效果明显。

目的 探讨围绕福尔马林固定石蜡包埋(formalin fixed paraffin embedded,FFPE)样本特性获取更高质量/得率的纳米磁珠核酸提取方案,改进分子病理技术.方法 合成4大类15个小类的备选磁珠,以FFPE样本为中心,筛选高质量/得率磁珠.模拟常规组织、粗针穿刺(肝脏)、纤维支气管镜样本(肺),装管相同张数连片.采用筛选的最佳磁珠与市场出售的常见磁珠试剂提取核酸,横向对比纯化总量、片段大小等质量参数.应用PCR和Sanger验证核酸的下游应用.结果 以FFPE样本DNA为中心筛选自制纳米磁珠,获得最佳性能纳米磁珠总回收率为58.5％±1.58％,5种市售商品化磁珠和3种国产磁珠总回收率为18.68％～40.71％.相同组织量(连片)提取的DNA总量,在模拟常规组织、粗针穿刺和纤维支气管镜样本核酸得率比市售试剂盒提高39.49％～181.72％(P＜0.05).模拟纤维支气管镜样本1张(4 μm)总量可达100 ng以上、5张总量可达400 ng以上.结论 以FFPE样本DNA为中心筛选的DNA纯化纳米磁珠,与商品化磁珠相比有较大提升,为临床分子病理检测的质量保证、自动化检测和项目拓展提供空间.

目的 建立一种快速、简单且高效提取细胞培养上清中外泌体的方法,以期促进外泌体在临床与疾病治疗中的应用.方法 将羟基(OH)修饰磁珠与高分子化合物Buffer EXD结合,建立新的外泌体提取系统,并使用该系统提取细胞培养上清中的外泌体.通过Western blot法检测外泌体标志蛋白的表达变化;纳米颗粒追踪分析(nanoparticles tracking analysis,NTA)技术检测外泌体的粒径大小和浓度;透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)技术检测外泌体的形态结构.对Buffer EXD系统提取外泌体的方法进行优化(提取pH、Buffer EXD比例、孵育时间、磁珠用量及种类).结合细胞培养和显微拍照技术分析新系统纯化的外泌体对A549细胞增殖的影响.结果 新系统提取的外泌体样品中标志蛋白Alix、CD9和CD81等表达水平较高,而外泌体阴性蛋白Calnexin表达较少;新系统提取的外泌体粒径峰值在100 nm左右,具有茶托状的典型形状.新系统的pH为5.0,Buffer EXD浓度为20％,1.75％的OH磁珠与样品孵育时间为40 min时,提取的外泌体样品中标志蛋白含量最高.新系统提取的外泌体对A549细胞的增殖具有明显的促进作用.结论 以OH修饰的磁珠为介质,结合高分子化合物Buffer EXD,成功建立了一种可快速、简单、高效地从细胞上清中提取结构完整、形态特征明显且具有生物学功能外泌体的新体系.

目的 通过构建靶蛋白固定化磁珠,从威廉环毛蚓Pheretima guillemi中垂钓出与靶蛋白(纤维蛋白原、纤溶酶原)直接作用的抗血栓活性大分子成分,并经液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术鉴定.方法 优化并合成纤维蛋白原、纤溶酶原固定化羧基磁珠,分别通过固定化量、透射电镜、傅里叶红外光谱仪、激光纳米粒度分析仪表征功能化磁珠的靶蛋白固定量、微观形态、官能团及表面带电性;利用功能化磁珠从威廉环毛蚓抗血栓部位DPf3中垂钓与靶蛋白直接作用的抗血栓大分子活性成分,洗脱后经 LC-MS/MS 技术分析,并结合威廉环毛蚓物种蛋白质数据库比对鉴定.结果 靶蛋白固定化磁珠的最佳制备方案为将纤维蛋白原(0.4 mg/mL)或纤溶酶原(1 mg/mL)与磁珠于 4℃混旋孵育 8 h,纤维蛋白原和纤溶酶原的最大偶联量分别为(9.84±2.17)μg/mg和(7.24±0.91)μg/mg;经表征,靶蛋白均已成功固定于磁珠表面.DPf3 经纤维蛋白原、纤溶酶原固定化磁珠垂钓所得洗脱液经扫描比对,分别鉴定到 20 种和 27 种蛋白质,多属于丝氨酸蛋白酶类成分.结论 通过磁珠配体垂钓策略和 LC-MS/MS 技术可从威廉环毛蚓中快速筛选和鉴定目标生物活性大分子,可为动物类中药大分子的分离鉴定提供参考.

目的 评价不同生物活性基团修饰的纳米磁珠核酸提取效能,为临床应用及结果评价提供一些依据.方法 通过不同生物活性基团修饰的纳米磁珠对检测乙型肝炎病毒的标本进行核酸提取,采用微量分光光度计(NanoDrop Onec)检测核酸的浓度及纯度,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测样本的CT值.结果 在几种纳米磁珠提取法中,超顺磁性羧基纳米微粒提取的核酸浓度及纯度最高(浓度平均为953.3 IU/mL),其次是二氧化硅磁性微球与羧基微球混合纳米磁珠及纳米磁性氧化物MnFe2O4提取法.羟基修饰二氧化硅颗粒以及壳聚糖包覆的磁珠提取的核酸浓度较高,但纯度较差(A260/280及A260/230比值均超出标准范围).对于同一样本,超顺磁性羧基纳米微粒提取的核酸扩增CT值为(21.28±0.36),核酸提取效率明显高于离心柱提取法,且具有统计学意义.二氧化硅磁性微球和羧基微球混合纳米磁珠、羟基修饰二氧化硅纳米磁珠及壳聚糖包覆的纳米磁珠核酸提取效率均低于离心柱提取法.此外,超顺磁性羧基纳米微粒的提取时间可缩短至15分钟.结论 超顺磁性羧基纳米微粒核酸提取效率、精密度及核酸产物纯度最高,有较大的临床应用价值.

目的:探讨来源于肾小管的尿液外泌体中的代谢物在评估糖尿病肾脏病(DKD)中的应用价值.方法:采用横断面研究,选择健康人群(13例)、单纯2型糖尿病(T2D)患者(12例)及T2D合并DKD患者(12例)作为研究对象,收集人口学和实验室检查等资料.培养原代肾小管上皮细胞.超速离心提取尿液及细胞培养上清液中的外泌体,免疫磁珠富集表达分化簇13(CD13)的外泌体,透射电镜及纳米颗粒跟踪分析外泌体的形态,Western blot和免疫组化染色检测蛋白质的表达和分布,ELISA检测肾损伤因子1和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白,超高效液相色谱-串联质谱方法靶向定量检测外泌体中的代谢物.采用偏最小二乘判别分析进行多维建模.代谢物的两组间比较采用Wilcox检验,多组间比较采用Kruskal-Wallis检验,Spearman相关分析法分析代谢物与临床指标的相关性,受试者工作特征(ROC)曲线评价诊断效能.结果:尿液外泌体中检测到CD13的表达.肾组织中CD13分布在肾小管的顶端侧.原代肾小管上皮细胞及其外泌体中均检测到CD13.在表达CD13的尿液外泌体中定量检测到144种代谢物.在单纯T2D和T2D合并DKD两组间筛选出差异具有统计学意义的15种代谢物(P<0.05),包括赖氨酸、N-乙酰丙氨酸、N-乙酰丝氨酸、正亮氨酸、N-苯乙酰苯丙氨酸、缬氨酸、鹅去氧胆酸、葡萄糖、肉豆蔻脑酸、油酸、辛二酸、十一烷酸、延胡索酸、酮亮氨酸和异戊酸,其中,N-乙酰丙氨酸、十一烷酸、酮亮氨酸、赖氨酸和鹅去氧胆酸均与尿蛋白和血尿酸显著相关(P<0.05或P<0.01).肉豆蔻脑酸、N-乙酰丙氨酸、缬氨酸和正亮氨酸的ROC曲线下面积分别为0.854(95%CI:0.705～1.000)、0.840(95%CI:0.677～1.000)、0.812(95%CI:0.640～0.985)和0.806(95%CI:0.630～0.982).结论:单纯T2D与T2D合并DKD的肾小管外泌体中的代谢物存在显著差异,从中筛选出的15种代谢物可作为临床诊断DKD的新途径.