目的:开发一种基于重组酶介导的等温扩增（RAA）和成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白（Cas13a）系统的幽门螺杆菌核酸检测体系。方法:选取2021—2022年于应急总医院收集的30株幽门螺杆菌以及大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌各2株。针对幽门螺杆菌UreC基因保守区序列，设计RAA-Cas13a 核酸检测体系所需的特异性引物及CRISPR RNA（crRNA）。再通过琼脂糖凝胶电泳筛选出产生非特异性产物最少的引物对，并应用Cas13a切割荧光探针产生的荧光强度筛选出切割效率最高的crRNA序列，构建了RAA-Cas13a核酸检测体系，通过检测梯度浓度稀释的幽门螺杆菌ATCC 43504基因组DNA以及5种不同的临床常见病原体基因组DNA，评价基于RAA-Cas13a核酸检测体系的最低检测限及特异性。通过RAA-Cas13a核酸检测体系与已建立的荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）方法同时检测临床菌株，得到该方法与qPCR方法的一致性。采用双侧配对 t检验对两组间的荧光值进行比较， P<0.05为差异有统计学意义。 结果:建立的RAA-Cas13a核酸检测系统可以在1 h内检测出低至10拷贝/μl的靶标DNA（ t=11.05， P<0.01），且与其他5种临床常见菌株无交叉反应。RAA-Cas13a方法与传统的qPCR方法具有良好的一致性，Kappa系数为1。 结论:建立了一种将RAA与CRISPR-Cas13a结合进行幽门螺杆菌检测的方法，可用于快速且灵敏的识别幽门螺杆菌感染。

目的:建立水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)的重组酶等温扩增(recombinase-aid amplification，RAA)快速检测方法。方法:通过全球共享数据库下载VZV全基因组序列进行比对分析，针对四个保守基因分别设计特异性引物与探针并筛选出最佳组合，通过引物与探针浓度梯度筛选出最佳反应体系，建立荧光型RAA检测方法。用VZV阳性质粒标准品与梯度稀释的临床样本评价方法的灵敏度，以最低检出极限浓度的阳性质粒标准品进行重复实验评价方法的重复性，以其他病毒核酸评价方法的特异性，同时用本方法和荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR，qPCR)对临床样本进行检测并对检测结果进行比较。结果:本方法筛选出针对开放阅读框架(open reading frame，ORF)28基因的引物对F2/R2与探针P2为最佳组合；考虑到成本因素，最佳引物浓度为500 nmol/L，最佳探针浓度为280 nmol/L；最低检出极限为10 1拷贝/μL，最低可检测到Ct值为36.027的临床阳性样本；重复实验的检测结果一致；该方法与其他病毒核酸无交叉反应；临床阳性样本的检出率为93.33%，与qPCR检测结果几乎完全一致。 结论:本方法操作简便、灵敏度高、特异性强、对实验条件要求低、检测结果直观可视，在20 min内就能够检测出样本中的VZV核酸，是一种可以被临床检测考虑的VZV快速检测方法。

目的:建立一种快速、灵敏、可视化的H7亚型禽流感病毒等温核酸扩增检测方法。方法:针对H7N9禽流感病毒的HA片段保守区序列设计引物、探针，优化反应温度，建立H7亚型禽流感病毒的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条检测技术，评价其特异性和敏感性，并与Real time PCR方法进行比较。结果:该方法检测H7亚型禽流感病毒的最低检出限为20拷贝/μL，与其他流感/禽流感病毒无交叉反应，反应可在20~50℃温度范围内进行，临床样本检测结果与Real time PCR法一致性为100.0％。结论:该检测方法具有快速、特异及灵敏的特点，为在基层和现场快速检测H7亚型禽流感病毒提供了新的方法。

目的:建立一种实时荧光逆转录重组酶介导的等温扩增（reverse transcription recombinase-aided amplification，RT-RAA）技术检测寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）的方法，以实现ZIKV的现场快速筛查及诊断。方法:通过基因组序列比对，选择ZIKV保守序列设计RT-RAA特异性引物和探针，并用系列稀释的ZIKV重组质粒与毒株核酸验证方法的灵敏性与重复性，通过检测登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒等其他虫媒病毒验证方法的特异性。结果:建立的RT-RAA方法可在39 ℃恒温条件下30 min内对ZIKV进行高效扩增，检测系列稀释的ZIKV重组质粒，其95%检测限可达到15拷贝/反应，特异性强，与登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒虫媒病毒无交叉反应，且重复性好。结论:本研究建立的ZIKV的RT-RAA等温扩增方法，具有反应迅速，无需精密仪器，操作简单等优点，适合于应急快速检测。

目的:建立基于SYBR Green I颜色判定的检测新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）ORF1ab基因的逆转录环介导等温扩增方法（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP），为诊断SARS-CoV-2提供简便、快速和准确可靠的工具。方法:基于GenBank中SARS-CoV-2 ORF1ab基因序列保守区设计引物，经引物筛选和RT-LAMP反应体系优化后进行灵敏度和特异性评价，并与实时荧光定量RT-PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）方法进行比较。结果:基于颜色判定的RT-LAMP方法可在65℃45 min内完成SARS-CoV-2的快速检测，检测限为3 copies/reaction，与qRT-PCR的敏感度一致。RT-LAMP检测人冠状病毒OC43、人冠状病毒NL63和乙型流感病毒核酸样本结果为阴性，具有较好的特异性。经SARS-CoV-2临床样本验证，RT-LAMP与qRT-PCR的检测符合率达100%。结论:基于颜色判定的RT-LAMP方法灵敏度高、特异性强，适用于SARS-CoV-2的快速可视化检测，具有应用于SARS-CoV-2样本的初筛及基层卫生医疗机构和现场推广的潜力。

目的:建立基于圆盘式（CD）微流控芯片的CALR基因突变的快速检测方法，初步评价其用于脑梗死患者CALR-1和CALR-2基因突变检测的应用价值。方法:基于微流控技术和环介导等温扩增（LAMP）技术建立一个用于CALR-1和CALR-2基因突变同步检测的CD微流控芯片检测平台，并验证该平台检测的灵敏度、特异性、重复性和准确性。前瞻性选取2019年11月至2021年3月复旦大学附属华山医院收治的124例脑梗死患者为脑梗死组，80名健康体检者为对照组。用CD微流控芯片法检测抗凝外周全血样本中的CALR-1和CALR-2基因突变情况，每块芯片同时检测4个样本，同步检测每个样本的3个指标，等温扩增40 min后读取结果。同时采用测序法对检测结果进行验证，比较2种检测结果的一致性。结果:采用CD微流控芯片平台，无需热循环，40 min即可完成样本中3个指标的同步扩增，样本的整个检测过程在60 min内完成。对核酸靶标浓度较高的样本，扩增10 min即可出现阳性信号，收到样本后30 min内报告检测结果。CD微流控芯片法针对CALR-1和CALR-2的检测灵敏度分别为1.0%和0.5%突变负荷浓度，对于其非靶标的核酸样本均未发生任何非特异性扩增，特异性良好，批内重复性和批间重复性的符合率均为100%（20/20）。在脑梗死组中发现2例CALR基因突变，且均为CALR-1突变（L367fs*46），对照组中未发现CALR-1和CALR-2基因突变。CD微流控芯片法与测序法结果一致率为100%（204/204）。结论:CD微流控芯片法用于检测脑梗死患者样本中CALR-1和CALR-2突变具有灵敏度高、特异性好、检测速度快和检测通量高等优势，有助于明确脑梗死患者的病因。

病毒性感染性/传染性疾病是严重影响人类生命健康的一类重大疾病，新发和突发传染病中也以病毒性居多。快速准确的病毒病原检测对于该类疾病的临床诊疗和预防控制具有重要意义。病毒核酸检测作为一种重要的辅助诊断方法，具有灵敏度高和特异性强等优势，现已成为明确病因、确定治疗方案、评估治疗效果和预后的重要手段。基于聚合酶链式反应、等温扩增技术和基因组测序等一系列方法已成功应用于病毒核酸检测。本文将从目前临床常用的病毒核酸检测方法与应用，以及结果解读中需注意的问题等方面进行讨论，助力病毒性感染性/传染性疾病的精准诊断与治疗。

目的:建立一种快速、准确、高灵敏度检测基孔肯雅病毒（chikungunya virus，CHIKV）的逆转录-酶促重组等温扩增（reverse transcription enzymatic recombinase amplification，RT-ERA）的基因检测技术方法。方法:以CHIKV非结构蛋白1（non-structural protein 1，NSP1）基因的保守序列为靶标，根据RT-ERA反应原理设计、合成荧光探针及对应引物，以pUC18为载体构建靶标质粒并在体外转录后作为阳性对照品，将阳性对照品倍比稀释后筛选出扩增效率最高的探针引物组合。利用筛选的探针引物组合，对不同拷贝数的CHIKV进行荧光RT-ERA法扩增，评价该方法的最低检出限；再分别以森林脑炎病毒、登革热病毒、寨卡病毒、乙型脑炎病毒、新布尼亚病毒的RNA为模板进行荧光RT-ERA法扩增，评价该方法的特异性。结果:在40 ℃恒温条件下，利用荧光RT-ERA法10 min内可以完成CHIKV核酸扩增，该方法最低检出限可达10拷贝/μL，且当CHIKV核酸扩增为阳性时，其他病毒检测结果为阴性。结论:成功建立一种可用于检测CHIKV NSP1基因的荧光RT-ERA法，该方法操作简便、检测限低且特异性好。

本研究使用环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和干式试剂技术，研发一种可以常温存储的结核分枝杆菌快速检测试剂。LAMP核酸扩增技术基于4或6条特异性引物，依靠链置换DNA聚合酶，使DNA在恒定温度下不断合成。所研LAMP技术反应体系使用实时荧光检测方法在20 min内检出结核分枝杆菌IS6110靶基因，且灵敏度接近PCR法，但精密度不及PCR法（LAMP法变异系数18.9%，PCR法变异系数3.4%），故LAMP法更适合定性检测。LAMP体系对脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、风疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道腺病毒（3 型）、呼吸道腺病毒（7 型）、呼吸道合胞病毒B和副流感病毒2型等10种病原体均无扩增，表现出较好的特异度。在此基础上，使用烘干和冻干技术，研发干式LAMP技术反应试剂。干式试剂在50 ℃环境下存储10 d性能无衰减，等效常温（25 ℃）可保存6个月以上。在临床样本测试中，干式试剂可20 min内有效检出结核分枝杆菌的核酸。综上，本文研发的常温存储快速检测试剂搭配等温扩增仪可对结核分枝杆菌进行快速鉴定。

幽门螺杆菌( Helicobacter pylori, Hp)与很多胃肠道疾病甚至是胃肠外疾病密切相关。目前幽门螺杆菌的常规检测技术包括快速尿素酶试验、病理组织学检查、血清抗体检测、粪便抗原检测、尿素呼气试验等，随着在临床应用中发现这些技术均存在不同程度的缺陷，因此需要探索新技术来弥补。恒温核酸扩增技术中的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术近年发展迅速，具有快速、特异、敏感、简便等特点，使该技术在核酸检测领域得到了广泛的应用。文章就Hp感染诊断及LAMP技术在诊断、毒力分型领域内的研究进展进行综述，期望为后续研究者们提供更多信息。