目的 以中药固体双向发酵方法,建立至真方的新型发酵工艺.方法 ①通过文献研究拟定候选发酵菌种.对候选发酵菌种进行平板混合实验,考察各菌种间生长兼容性.采用CCK-8 细胞增殖抑制实验,比较不同发酵条件下所得产物对人结直肠癌细胞(HCT-8)的半数抑制浓度(IC50),评判发酵体系的优劣,从而确定发酵菌种、发酵时长等关键发酵参数,建立发酵工艺.②通过 HCT-8 细胞增殖抑制率,以及巨噬细胞(RAW264.7)NO释放率和吞噬活性测定,比较至真方发酵前后的体外药效差异.结果 黑曲霉和酵母菌为最优发酵菌种组合,4 d为最优发酵时长.在此发酵条件下,发酵组对HCT-8 细胞的IC50 为 67.41 μg·mL-1,生药组对HCT-8 细胞的IC50 为 1 032 μg·mL-1;与生药组比较,发酵组能显著抑制RAW264.7 释放炎症因子NO,并显著提升其吞噬活性.结论 该研究建立了至真方固体双向发酵新工艺.在该发酵体系下,至真方的体外抗结直肠癌活性、抗炎活性和促免疫活性得到显著提升.

[目的]探讨至真方醇提物(ZZR)对大肠癌多药耐药细胞HCT-8/5-FU细胞耐药性的改善作用,并从Hedgehog/ABCG2信号途径探讨至真方改善大肠癌多药耐药的可能作用机制.[方法]高效液相色谱法鉴定至真方醇提物中的5种主要成分;CCK-8法检测大肠癌多药耐药细胞HCT-8/5-FU的多药耐药性及至真方对其耐药性的改善作用;应用Real-Time PCR和western blot方法分别从基因和蛋白水平检测至真方对Hedghog/ABCG2信号途径的调节作用.[结果]HCT-8/5-FU细胞有明显多药耐药性,至真方醇提物干预HCT-8/5-FU细胞48 h后,能增加其对不同化疗药物(5-FU、L-OHP、Taxol)的敏感性,且Hedgehog通路上关键因子-Glil与ABCG2的mRNA相对表达量均明显下调(P＜0.05),蛋白表达下降(P＜0.05).[结论]至真方醇提物能够有效改善HCT8/5-FU细胞多药耐药,其机制可能与抑制Hedgehog信号通路活性从而降低ABCG2蛋白表达有关.

多药耐药是导致大肠癌化疗失败的主要原因之一.研究表明肠胃清、至真方、左金丸等中药复方,白花蛇舌草、徐长卿等中药,以及苦参碱、姜黄素、吴茱萸碱等中药单体可以逆转大肠癌多药耐药,其机制涉及多药耐药的多个方面,包括:①抑制膜转运蛋白过度表达(如P-gp、MRP等),提高胞内药物浓度;②抑制NF-κB信号转导;③抑制抗凋亡基因表达,如Survivin;④抑制Hedgehog信号转导;⑤抑制MAPK信号转导;⑥抑制上皮-间质转化等.此外,中药还对耐药大肠癌细胞具有直接的抗癌作用.合理应用这些研究成果将有助于提高大肠癌的临床治疗疗效.

[目的]探讨至真方对大肠癌HCT116/L-OHP细胞耐药性的影响,并从自噬角度探讨至真方改善大肠癌HCT116/L-OHP耐药的可能作用机制.[方法]CCK-8及Western blot检测大肠癌HCT116/L-OHP细胞耐药性;mRFP-GFP-LC3双荧光自噬指示体系检测至真方对大肠癌HCT116/L-OHP细胞自噬的影响;流式细胞术检测至真方对大肠癌HCT116/L-OHP细胞凋亡诱导作用;Western blot检测至真方干预后耐药细胞自噬标志蛋白Bec-lin-1、SQSTM1/P62、LC3的表达.[结果]至真方可下调LC3、Beclin-1、上调SQSTM1/P62的表达(P＜0.05),经低、中、高浓度干预后凋亡率分别为5.1％、7.7％、13.1％(P＜0.05).mRFP-GFP-LC3双荧光自噬指示体系检测发现至真方干预组随着浓度的降低,黄点(自噬体)和红点(自噬溶酶体)数量均减少(P＜0.05).[结论]至真方可通过抑制HCT-116/L-OHP细胞自噬活性,增加大肠癌HCT-116/L-OHP细胞凋亡率,恢复其部分敏感性.

目的:探讨至真方通过调控M2巨噬细胞来源的外泌体逆转大肠癌细胞耐药的机制.方法:采取差异超速离心法分别提取M2巨噬细胞来源的外泌体以及100 μg/mL至真方醇提物预处理的M2型巨噬细胞来源的外泌体;用透射电子显微镜观察外泌体的形态,Western blot鉴定外泌体的标志蛋白;通过共培养体系将HCT116细胞分为3组:对照组(HCT116+PBS)、M2型巨噬细胞来源的外泌体与HCT116细胞共培养组(HCT116+M2-Exo)、至真方醇提物预处理的外泌体与HCT116细胞共培养组(HCT116+M2-Exo-ZZF),使用CCK-8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测耐药蛋白、凋亡蛋白表达.结果:M2型巨噬细胞在体外成功诱导(P＜0.01),分离并鉴定了外泌体.M2型巨噬细胞来源的外泌体与HCT116细胞共培养后,肿瘤细胞增殖率增强(P＜0.01)、凋亡率减少(P＜0.01);使用至真方醇提物预处理后,肿瘤细胞增殖率减弱(P＜0.05)、凋亡率增加(P＜0.01),并且耐药蛋白ABCB1、ABCG2的相对表达量均下调(P＜0.05),同时凋亡抑制蛋白Bcl-2表达下调(P＜0.05)、促凋亡蛋白Bax表达上调(P＜0.01).结论:至真方醇提物能够干预M2型巨噬细胞外泌体,使肿瘤细胞增殖减弱,促进肿瘤细胞凋亡并影响耐药蛋白表达从而降低结肠癌HCT116细胞对5-Fu的耐药性.

目的:探究真方白丸子联合丁苯酞治疗急性脑梗死的临床疗效及对神经功能恢复的影响.方法:选取我院2019年1月至2022年1月收治的68例急性脑梗死患者.按照随机数字表法分为联用组(n=34,真方白丸子联合丁苯酞治疗)和常规组(n=34,丁苯酞治疗).对比两组患者的临床疗效,治疗前后中医症候积分、神经功能恢复及不良反应情况.结果:联用组治愈及显效例数均高于常规组,且总体有效率高于常规组(P＜0.05);两组患者治疗后中医症候积分均明显下降,且联用组低于常规组(P＜0.05);联用组患者治疗后卒中量表(NIHSS)评分低于常规组(P＜0.05);治疗后,两组不良反应比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论:真方白丸子联合丁苯酞治疗急性脑梗死临床疗效佳,可明显改善脑部缺血情况,促进神经功能恢复.