目的 建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)融合前F蛋白(prefusion F protein,pre-F)三聚体定量检测方法,并对其进行方法学验证和初步应用.方法 选取RSV pre-F三聚体特异性抗体AM14 作为捕获抗体,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的RSV pre-F特异性抗体D25 作为检测抗体,通过方阵滴定法确定捕获抗体和检测抗体的最佳浓度,对封闭液进行优化,建立双抗体夹心ELISA.分别对该方法的专属性、准确度、精密度和耐用性进行验证,并应用于RSV亚单位疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测.结果 该方法确定的捕获抗体AM14 包被浓度为 1.25 μg/mL,检测抗体D25 浓度为0.50 μg/mL,封闭液为1%牛血清白蛋白(bo-vine serum albumin,BSA).方法验证结果显示,线性范围为 1.50～24.00 ng/mL,标准曲线R2>0.99,最低检测限可达1.33 ng/mL;该方法专属性良好,仅与RSV pre-F三聚体反应;准确度和精密度验证结果显示回收率为 87.41%～117.03%,变异系数(coefficient of variation,CV)为 5.47%～14.07%;检测抗体孵育时间及显色时间在一定范围内波动时,回收率在 87.65%～106.45%,证明该方法耐用性优良;该方法可应用于RSV pre-F发酵和纯化等样品的检测.结论 成功建立并验证RSV pre-F三聚体定量检测方法,该方法专属性强,准确度、精密度、耐用性均优良,可应用于RSV疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测,无需Octet或者Biacore等精密仪器,具有操作简单、定量准确、成本低、便于推广应用等优点.

《齐民要术》造神曲法对后世六神曲的影响深远。药物组成方面：面曲延续至今，后世发展了全麸麦曲与麸曲。野蓼的范围逐渐缩小到辣蓼与红蓼。神曲的制作加工工艺方面：诸鲜药由水煮发展为捣汁与水煮并行，小麦由蒸炒生并用简化为仅用生麦。曲饼“溲欲刚”的干湿程度至今仍为业界圭臬。曲饼的成型方法手抟与用模具成型均有传承。覆盖曲饼的材料由麦秸、青蒿扩展到黄荆，并使用麻叶、楮叶、纸等包裹曲饼。对于发酵过程中的翻曲、聚曲、瓮盛的工艺后世没有传承。晾晒的方法由成串曲饼悬挂发展为纸包单独悬挂。罨曲法至今仍为主流，后世扩展了风曲法与造酱黄法。现代神曲的罨曲法与造酱黄法的制作工艺仍不出《齐民要术》这一渊薮，而添加旧曲的 曲法的基础，仍是罨曲法。尚需进一步研究的问题有：青蒿、辣蓼、苍耳的入药方式；曲饼的形制；单一菌种发酵或优势种群发酵研究；风曲法的研究；曲饼包裹与覆盖的材料研究；面曲、全麸麦曲、麸曲的比较。

目的:探讨经赤芝菌发酵不同时间钩吻（赤芝钩吻）的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱与毒性的关系。方法:用赤芝菌对钩吻进行双向固体发酵炮制，取发酵9、11、13、15、17、19、21、23、25、27 d（第27天取样2次）共10批次（批号S1~S10）赤芝钩吻，采用自行建立的HPLC法测定指纹图谱。将100只无特定病原体级ICR小鼠随机分为10组（每组10只，雌雄各半），以发酵11 d赤芝钩吻对小鼠的半数致死剂量为毒性测定给药浓度配制S1~S10赤芝钩吻溶液，分别给10组小鼠灌胃，观察各组小鼠的死亡情况。根据灰色关联度计算公式计算S1~S10赤芝钩吻指纹图谱共有色谱峰与毒性（对小鼠的致死率）的关联度系数，分析赤芝钩吻毒性的主要贡献成分。结果:S1~S10赤芝钩吻指纹图谱共标定17个共有色谱峰；S1~S10赤芝钩吻对小鼠的致死率分别为1.00、1.00、0.80、0.70、0.60、0.60、0.50、0.40、0、0。灰色关联度分析显示，7、3、6、9、1、8、17、12号共有色谱峰与毒性的关联度系数分别为0.868、0.838、0.830、0.828、0.824、0.820、0.818和0.802，这8个色谱峰所代表的化学成分为赤芝钩吻毒性的主要贡献成分。结论:赤芝钩吻随发酵时间延长毒性逐渐降低，发酵27 d时毒性最低。发酵后钩吻的毒性是多成分共同作用的结果，毒性主要贡献成分的辨识可为发酵钩吻的质量控制和发酵工艺优化提供参考。

目的:利用毕赤酵母高效表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域(receptor binding domain，RBD)，并评估以该RBD蛋白作为抗原所制备的疫苗组合物的免疫原性。方法:选取RBD蛋白并合成对应基因片段，将其构建至pPICZαA质粒，质粒经线性化转化后整合到毕赤酵母基因组中进行重组表达。Western blot和基于BLI(Biolayer Interferometry)技术的定量分析方法对培养上清中RBD蛋白进行检测，筛选能够分泌表达RBD蛋白的单克隆菌株。通过优化发酵工艺，包括培养基的盐浓度调整和诱导条件优化(pH、温度和时间等参数)，实现RBD蛋白的高效表达，并在小鼠体内评估其免疫原性。结果:筛选获得重组RBD蛋白表达效果较好的RBD-X33单克隆菌株。通过优化后的发酵工艺，即采用HBSM培养基、诱导pH为6.5±0.3、诱导温度为22℃、诱导时间持续120 h，实现发酵收获上清中重组RBD的表达量达到240 mg/L。在小鼠免疫原性试验中，采用铝+CpG双佐剂系统吸附重组RBD蛋白的疫苗组合物能够激发小鼠产生2.7×10 6结合抗体滴度和726.8活病毒(野生型)中和抗体滴度。 结论:采用毕赤酵母表达系统能够高效表达重组RBD蛋白，且所表达的RBD蛋白能够有效激发动物产生免疫应答。本研究为基于RBD蛋白的重组新型冠状病毒疫苗的开发提供了参考。

视黄醇是维生素A的主要活性形式之一,对于机体的生长发育、眼部和皮肤功能维持至关重要,被广泛应用于化妆品、医药和饲料添加领域.动物体内不具备完整的维生素A合成途径,但可通过膳食直接摄入或将膳食中获得的β-胡萝卜素转化获得.为了推进视黄醇的生物法合成研究,首先以β-胡萝卜素合成平台CAR?1 为基础,筛选了 3 种不同来源的醇脱氢酶,确定了大肠杆菌来源的ybbO具有最高的催化活性,转化率可达 95.6%.为了进一步提高反应速率和产量,采用蛋白质融合技术将视黄醇合成模块中 2 个相邻酶blh和ybbO进行融合后,在高产β-胡萝卜素工程菌株CAR?3 中进行评估,获得了最优组合blh-GGGS-ybbO,其产量较融合前提高了 44.9%,达到(111.1±3.5)mg·L-1.进一步工作中,通过引入人源的视黄醇结合蛋白(RBP4)以及转甲状腺素蛋白(TTR),在酿酒酵母中模拟了人体肝脏细胞分泌视黄醇的过程,视黄醇产量增加至(158.0±13.1)mg·L-1.最后,采用过表达INO2 扩张β-胡萝卜素合成途径反应区室,提高血红蛋白VHb表达量以增强氧气的供给,强化PDR3m表达促进视黄醇的转运和开发 2 个阶段发酵工艺等方法,在 5 L发酵罐中成功将视黄醇的产量提升至(2 320.0±26.0)mg·L-1,为视黄醇产业化发展提供了重要基础.

随着人们生活水平的提高及城市化进程加快,垃圾产生量逐年激增,其资源化处理已成社会共识.好氧堆肥作为厨余垃圾资源化的主要方式,具有巨大的研究潜力和研究前景.好氧堆肥处理厨余垃圾有助于土壤固碳,降低大气CO2含量,更可获得有机肥料,符合目前"碳中和"和化肥减量化的政策.基于此,本文总结了好氧堆肥基本机制及微生物菌剂的作用,并对厨余堆肥腐熟度的评价和相应的肥料应用进行了综述.堆肥方式、含水率、碳氮比、通气量、温度和辅料种类等会影响厨余堆肥的效果,未来应进一步优化工艺,在发酵时间和处理成本之间获得最佳的平衡,不断完善堆肥产品腐熟度的评价指标,加强厨余垃圾有机肥的肥效评估.

目的 以中药固体双向发酵方法,建立至真方的新型发酵工艺.方法 ①通过文献研究拟定候选发酵菌种.对候选发酵菌种进行平板混合实验,考察各菌种间生长兼容性.采用CCK-8 细胞增殖抑制实验,比较不同发酵条件下所得产物对人结直肠癌细胞(HCT-8)的半数抑制浓度(IC50),评判发酵体系的优劣,从而确定发酵菌种、发酵时长等关键发酵参数,建立发酵工艺.②通过 HCT-8 细胞增殖抑制率,以及巨噬细胞(RAW264.7)NO释放率和吞噬活性测定,比较至真方发酵前后的体外药效差异.结果 黑曲霉和酵母菌为最优发酵菌种组合,4 d为最优发酵时长.在此发酵条件下,发酵组对HCT-8 细胞的IC50 为 67.41 μg·mL-1,生药组对HCT-8 细胞的IC50 为 1 032 μg·mL-1;与生药组比较,发酵组能显著抑制RAW264.7 释放炎症因子NO,并显著提升其吞噬活性.结论 该研究建立了至真方固体双向发酵新工艺.在该发酵体系下,至真方的体外抗结直肠癌活性、抗炎活性和促免疫活性得到显著提升.

灵菌红素是一种天然的红色三吡咯色素,主要源自于微生物的次级代谢过程,其具有抗菌、抗肿瘤等功能,在医药、环境、染料等领域具有广阔的应用前景.随着合成生物学技术的不断发展,利用微生物发酵法合成灵菌红素是实现灵菌红素工业化生产的有效途径之一.目前,生产灵菌红素的微生物主要以粘质沙雷氏菌为主.本文系统介绍了灵菌红素的结构性质和应用潜力,重点阐述了粘质沙雷氏菌中灵菌红素的合成路径,总结了通过高产菌株选育与改造、发酵工艺优化和转录因子调控等策略提高灵菌红素合成的最新研究进展,分析了不同提取纯化工艺的效率,并对未来灵菌红素的高效合成进行了展望,以进一步提高灵菌红素的工业化生产效率.

目的 以三七药渣为原料,通过益生菌发酵比较不同益生菌以及复合益生菌对各指标成分影响的差异,探究最佳发酵工艺.方法 采用单因素、Box-Behnken响应面法优化发酵工艺,并通过体外抗氧化实验评价发酵产物的抗氧化能力.结果 最佳发酵工艺为有氧发酵 48 h、厌氧发酵 36 h,嗜热链球菌、两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌的比例为 2∶3∶1,料液比0.14 g·mL-1,接菌量 5%,温度 33℃.在最佳发酵工艺条件下,三七药渣中性多糖、酸性多糖、总黄酮的含量分别提高了105.64%、96.98%、123.83%,相较于单菌发酵均显著升高.发酵产物清除 DPPH、ABTS 自由基的 IC50 值分别为 1.774、3.065 mg·mL-1,还原Fe3+的能力为 0.138 mmol FeSO4·g-1,较未发酵药渣显著增强.结论 最佳发酵工艺能显著提高三七药渣中各指标成分含量,显著增强其抗氧化能力,相较单菌发酵各指标成分含量均显著提高,提示上述益生菌之间没有明显的拮抗作用.研究结果为三七药渣的资源化利用提供了科学依据和数据支撑.

二十二碳六烯酸(DHA)作为人体必需的多不饱和脂肪酸,在维护心血管健康、抗癌、支持视觉和脑功能等方面至关重要.传统的深海鱼油提取DHA方法存在鱼腥味重、工艺繁琐等问题,迫使研究者寻求更为高效、环保的替代方案.破囊壶菌(Thraustochytrids)凭借其生长迅速、低重金属污染以及高DHA含量的特性,成为工业化生产DHA的潜力微生物之一.当前在破囊壶菌发酵生产DHA的过程中,依然需要解决一系列关键问题,包括提高发酵产量、降低成本等.本文旨在全面阐述破囊壶菌发酵生产DHA的研究现状,包括菌株筛选与改良、DHA生物合成途径、遗传转化及代谢工程、发酵控制策略等方面.首先,总结归纳了对野生型菌株的自然筛选和诱变改良等方法,不断提高破囊壶菌中DHA产油量.其次,详细介绍了破囊壶菌DHA合成途径的研究进展,着重分析了生物合成途径中关键辅助因子在DHA生产中的作用.此外,概述了外源DNA传递到破囊壶菌细胞的遗传转化技术的应用现状,为提高其遗传转化效率和稳定性提供重要参考.在DHA代谢调控方面,探讨了氮限制对DHA合成的促进作用以及温度和氧气供应对生产效率的影响.最后,对利用破囊壶菌生产DHA存在的主要瓶颈问题和未来发展趋势进行了总结,以推动其在医药、保健品和食品等领域的广泛应用,实现工业规模下的高效生产.