目的:设计基于纳米荧光素酶(Nluc)的新型荧光报告系统，构建新型分枝杆菌荧光报告噬菌体ΦFN，分析该噬菌体检测结核分枝杆菌耐药性的能力。方法:构建P furAma启动子控制表达的Nluc荧光报告系统，将其整合至耻垢分枝杆菌基因组中，测试其在分枝杆菌的荧光报告能力；随后将P furAma- nluc报告系统整合到TM4分枝杆菌噬菌体基因组中，构建新型分枝杆菌荧光报告噬菌体ΦFN；通过调整药物预处理时间、感染时间等条件，建立ΦFN检测分枝杆菌耐药性的快速检测流程，在96孔板中检测52株已知耐药性的结核分枝杆菌临床分离株对3种一线抗结核药物耐药的耐药性。 结果:整合型表达荧光报告系统P furAma- nluc的耻垢分枝杆菌可报告下限达到100菌落形成单位(colony-forming unit，CFU)，低于已报道的P left启动子表达 nluc系统。新型分枝杆菌荧光报告噬菌体ΦFN可通过孔板读值法在24 h内检测到分枝杆菌的存在，检测下限达到100 CFU。药物与待测菌预培养48 h后再加入噬菌体孵育24 h，敏感菌在10 5 CFU以下均无法检测到荧光信号，可有效区分敏感株并进行耐药性的快速检测。以罗氏药敏实验作为金标准，使用ΦFN检测52株结核分枝杆菌临床菌株对利福平、异烟肼和链霉素的耐药性，检测准确性分别是51/52、48/52、49/52。 结论:利用新型重组荧光报告噬菌体检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、链霉素的耐药性具有极高的准确性，报告时间仅需3 d，有望成为一种快速简便的结核分枝杆菌耐药性检测新方法。

目的:探究人源化膜金属蛋白酶——含有TRAB结构域的蛋白2A（TRABD2A）单克隆抗体对接受联合抗逆转录病毒疗法（cART）的人免疫缺陷病毒（HIV-1）感染者储存库细胞的作用效果，建立基于TRABD2A阻断抗体的全新HIV-1储存库检测方法。方法:2021年5—12月于中国医科大学附属第一医院收集研究对象51例。其中健康者2名，接受cART的HIV-1感染者（cART组）41例，未接受cART的HIV-1感染者（no-cART组）8例。采用噬菌体展示库技术构建人源化TRABD2A单克隆抗体，分别处理HIV-1感染者、未接受cART的HIV-1感染者及健康对照者的外周血单个核细胞（PBMC）和CD4+T淋巴细胞，利用荧光素酶报告系统、单分子免疫阵列检测技术等方法检测细胞培养上清中病毒含量，同时使用流式细胞术、荧光实时定量聚合酶链式反应检测处理后细胞的活化和病毒基因表达情况，比较不同处理组之间病毒释放量和表面活化标志CD25、CD69、HLA-DR（人类白细胞DR抗原）表达量的差异。结果:接受cART的HIV-1感染者的PBMC经人源化TRABD2A单克隆抗体处理后检测HIV-1产量，未处理组为0（0，440），使用负抗体所释放的病毒量为0（0，390），二者差异无统计学意义（ P>0.05），而使用正抗体所释放的病毒量为1 259（0，4 269）和3 142（1 292，5 060），与使用负抗体所释放的病毒量相比，差异均有统计学意义（ P<0.05）。利用健康对照者PBMC对感染者PBMC进行倍比稀释，经正抗体处理后病毒释放量等比例下降［未稀释、稀释5、25、125、625倍对应的HIV-1产量分别为4 670（3 339，7 697）、1 860（1 509，4 615）、1 550（1 150，2 680）、602（255，1 441）、2（0，37）］。且TRABD2A单抗处理后的细胞静息状态与未处理组差异无统计学意义（未处理组与正抗体-1处理组的CD25阳性细胞百分率分别为3.89±1.31、4.60±1.74，CD69阳性细胞百分率分别为2.50±1.27、2.18±0.51，HLA-DR阳性细胞百分率分别为7.66±3.78、8.79±3.42； P均>0.05），未处理与正抗体-1的病毒群抗原基因（Gag）表达量分别为1和0.82±0.55，差异无统计学意义（ P>0.05）。 结论:人源化TRABD2A单克隆抗体能够有效阻断TRABD2A的蛋白活性，可在不改变细胞静息状态和全基因组转录水平的情况下，显著促进HIV-1感染者外周血中储存库细胞释放子代病毒，且通过此方式所引起的储存库病毒释放量与储存库细胞数量呈正相关。

目的 比较BACTEC MGIT 960药敏法(BD960)、噬菌体生物扩增法(pha B)、荧光定量PCR探针熔解曲线法(PCR法)3种方法检测结核分枝杆菌耐药的临床效能,并评估其应用价值.方法 收集结核分枝杆菌阳性的临床分离株,采用BD960法、pha B法和PCR法检测抗结核一线药物耐药情况,比较3种方法的检测结果.结果 pha B法和PCR法平均报告时间明显短于BD960法,PCR法平均报告时间明显短于pha B法,差异有统计学意义(P＜0.05).3种方法对80株临床分离株进行链霉素(streptomycin,SM)、异烟肼(isoniazid,INH)、利福平(rifampin,RFP)和乙胺丁醇(ethambutol,EMB)耐药检测,耐药检出结果差异均无统计学意义(P＞0.05).以BD960法检测结果作为对照,pha B法对SM、INH和RFP耐药检测结果均为高度一致,对EMB检测结果为中度一致;PCR法对INH和RFP耐药检测结果高度一致,对SM和EMB检测结果为中度一致.结论 应用PCR法和pha B能快速筛查结核分枝杆菌对一线抗结核药物的耐药情况.

目的 筛选能感染结核分枝杆菌的溶源性噬菌体,了解其生物学及遗传学信息.方法 从土壤中分离纯化噬菌体;电镜观察噬菌体形态;单斑法测定宿主谱;提取噬菌体DNA,鸟枪法随机测序.采用DNAStar软件包分析基因组成分,Glimmer3.0、GeneMark软件预测基因功能,同时做共线性分析.分离溶源菌,通过紫外线诱导试验、超免反应验证噬菌体溶源性.结果 分离到一株新的噬菌体Chy5,其头部直径(61.5±1.4) nm,尾部长度(114.1±2.1) nm,为长尾噬菌体,可感染敏感及耐药结核菌株.Chy5基因组全长51 214 bp,G+C含量63.60％,与噬菌体D29基因组最相似,有88个推定基因,含有编码整合酶和阻遏蛋白的基因以及attP位点.经紫外线诱导Chy5溶源菌可形成噬菌斑,Chy5与其溶源菌共培养会发生超免反应.结论 分离到一株新的能感染敏感及耐药结核菌的溶源性噬菌体Chy5,其基因组与噬菌体D29相似,有望应用于构建荧光报告噬菌体.

人工转录装置可以按照所设计的方式在原核细胞和真核细胞中调节基因表达.本研究在大肠杆菌中设计并构建了一种由合成启动子和人工转录因子构成的人工转录装置:其中,合成启动子包含了一种弱启动子Pk突变体与位于其上游的λ噬菌体操纵区(OR2或OR3)的不同组合,而人工转录因子则利用细菌RNA聚合酶α亚基的N端和λ噬菌体CI蛋白的C端组成的融合蛋白α-CI作为效应域,CI蛋白作为DNA结合结构域.利用绿荧光蛋白作为报告基因对这一人工转录装置检测发现,它可以成功开启报告基因的转录活性.随后通过改变这一人工转录装置的某些参数,例如,增加启动子上游操纵序列的拷贝数、使用温敏型CI取代野生型CI、在系统中引入CI的阻遏蛋白Cro等多种方式,实现了对报告基因转录强度的精细调控.这一人工可调控转录装置可以在原核细胞中实现对报告基因表达强度的精细调控,在原核细胞中调节基因线路的信号输出强度方面具有一定的应用前景.

目的 利用建立的西尼罗假病毒报告系统,体外筛选获得抗西尼罗病毒抗体.方法 首先,利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测由噬菌体展示技术筛选获得的13株抗西尼罗病毒候选抗体与靶蛋白-西尼罗病毒E蛋白结构域Ⅲ(DⅢ)的结合;其次,将收集的含有西尼罗假病毒的细胞培养上清稀释102倍,分别与相应浓度的候选抗体室温孵育1 h后,将假病毒上清+抗体混合液感染BHK21或者K562细胞,48 h后,裂解细胞测荧光素酶活性(RLU).结果 13株候选抗体均能识别并结合西尼罗病毒E蛋白DⅢ;其中2株抗体(抗体5和7)具有较好的中和活性,低浓度下(5 mg/L)即能有效阻断病毒入侵靶细胞;而2株抗体(抗体3和8)具有抗体增强效应(ADE),表现为靶细胞病毒感染增强.结论 利用建立的西尼罗假病毒报告系统,体外筛选获得2株具有中和活性的抗西尼罗病毒抗体.

产毒素的霍乱弧菌Vibrio cholerae可导致严重腹泻,已引起7次全球大流行.对于烈性噬菌体清除霍乱弧菌的效果评价上,一般使用传统的活细胞培养计数及噬菌斑进行观察分析,但操作费时耗力,尤其不能实时获得菌株被裂解及残存细胞的数量变化.进一步探索简便、能够实时监测噬菌体裂解霍乱弧菌的方法是非常必要的.利用荧光报告质粒的策略、将可在霍乱弧菌中高表达生物冷光的质粒转化至O1血清群霍乱弧菌耐药菌株中,通过测定比较生物冷光以及活菌计数,实时分析了噬菌体对液体培养状态下霍乱弧菌的裂解效果,结果显示:冷光值作为监测指标与传统的活细胞计数方法有很高的相关性,通过测定霍乱弧菌耐药株的冷光值监测霍乱弧菌活细胞的数量,可实时分析噬菌体裂解霍乱弧菌过程中细菌残存数量.这种分析方法与菌落计数和噬斑形成观察相比,能够重复对同一样本进行无干扰的连续多时间点检测,没有经过再培养或噬斑形成的时间迟滞,有利于进行噬菌体与宿主菌相互作用的实时监测分析.

[目的]构建携带锚定序列的真核表达载体,研究T7噬菌体识别、包裹和转运真核表达载体进入细胞实现蛋白表达的可行性,为DNA疫苗研发建立新的技术平台.[方法]本研究通过重叠延伸PCR方法获得候选锚定序列并插入真核表达载体;建立荧光定量PCR方法比较T7噬菌体识别、包裹真核表达载体的效率;激光共聚焦显微镜观察T7噬菌体转运真核表达载体进入细胞实现报告基因的表达.[结果]获得4条锚定序列(AS1-4)并成功插入pcDNA3.0-EGFP真核表达载体;其中携带2号锚定序列(pcDNA3.0-EGFP-AS2)的真核表达载体可被T7噬菌体高效识别,对其包裹效率高达95％;T7噬菌体包裹真核表达载体可以抵御核酸酶对质粒的降解,并且转运真核表达载体进入树突状细胞内部实现报告基因EGFP的表达.[结论]该研究表明,T7噬菌体通过识别锚定序列将真核表达载体包裹进衣壳内部,完整的噬菌体颗粒作为转运工具将真核表达载体运送至细胞内部实现表达,这为DNA疫苗研发提供新的技术平台.