目的:初步探讨高危型人乳头瘤病毒16(human papillomavirus 16，HPV16)E6蛋白促进宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移的潜在免疫调控分子机制。方法:构建HPV16 E6蛋白过表达慢病毒并感染C33A细胞，获得C33A-E6稳定细胞系，采用qRT-PCR和Western blot法检测C33A和C33A-E6组细胞内HSP70的表达。放线菌素D(ActD)和放线菌酮(CHX)处理细胞后不同时间采用qRT-PCR和Western blot法分别检测HSP70 mRNA和蛋白质降解速率。超速离心法提取两组细胞外泌体，酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测外泌体中HSP70含量。提取C33A和C33A-E6细胞干扰HSP70表达后的外泌体，ELISA检测经外泌体处理的THP-1细胞培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的表达水平。将外泌体处理的THP-1细胞与C33A细胞共培养，CCK-8法检测C33A细胞增殖。Transwell小室评估C33A细胞侵袭和迁移状态。结果:与C33A细胞相比，C33A-E6细胞HSP70 mRNA水平显著增高( P<0.05)，但蛋白质水平没有明显变化( P>0.05)。经ActD/CHX处理不同时间的两组细胞中HSP70 mRNA和蛋白质降解速率差异无统计学意义( P>0.05)，但C33A-E6组分泌的外泌体中HSP70含量明显增高( P<0.001)。C33A-E6细胞分泌的外泌体可增强THP-1细胞分泌IL-6、TNF-α和IL-10的水平( P<0.001)，并且外泌体处理后的THP-1细胞可促进C33A细胞增殖、迁移和侵袭( P<0.001)；而干扰C33A-E6细胞中HSP70的表达可显著降低外泌体诱导的THP-1细胞分泌IL-6和IL-10及THP-1细胞对C33A细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用( P<0.001)。 结论:高危型HPV16 E6蛋白可上调宫颈癌细胞外泌体中HSP70的表达，进而促进巨噬细胞分泌IL-6和IL-10，并介导宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭。

目的:浮舰蛋白(flotillin-2,FLOT2)是典型的致瘤蛋白和潜在的肿瘤治疗靶点,但靶向FLOT2的干预策略仍未确定.翻译后修饰作为表观调控的重要方式,对蛋白质的活性、定位和稳定性等特性具有重要的调控作用,揭示蛋白质翻译后修饰的调控机制和功能是靶向治疗开发的一种有效手段.本研究旨在研究鼻咽癌中FLOT2赖氨酸乙酰化修饰的调控机制及其功能,为靶向FLOT2的肿瘤干预手段提供新思路.方法:利用PhosphoSitePlus数据库分析FLOT2的赖氨酸乙酰化位点,并构建赖氨酸乙酰化位点突变的FLOT2突变体[FLOT2(K211R)];用组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDAC)抑制剂曲古菌素A(trichostatin A,TSA)、Sirt家族去乙酰化酶抑制剂烟酰胺(nicotinamide,NAM)处理鼻咽癌细胞,TSA处理转染FLOT2突变体质粒的人胚肾细胞(human embryonic kidney,HEK)-293T细胞;利用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)检测FLOT2的总赖氨酸乙酰化水平以及特定赖氨酸(K)位点突变对FLOT2总赖氨酸乙酰化水平的影响.用蛋白质印迹法检测TSA处理未转染/转染FLOT2突变体质粒后的鼻咽癌细胞中FLOT2/FLAG-FLOT2的蛋白质表达,实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR,real-time RT-PCR)检测TSA处理后鼻咽癌细胞中FLOT2 mRNA的表达.用TSA分别联合MG132或氯喹(chloroquine,CQ)处理鼻咽癌细胞后,检测FLOT2的蛋白质表达.用放线菌酮(cycloheximide,CHX)分别处理已转染FLAG-FLOT2(WT)或FLAG-FLOT2(K211R)质粒的HEK-293T细胞,检测FLAG-FLOT2、FLOT2(K211R)的蛋白质表达水平以反映蛋白质的降解速率.通过BioGrid数据库查询FLOT2与HDAC6之间是否可能存在相互作用,并采用Co-IP验证.用FLAG-FLOT2(WT)/FLAG-FLOT2(K211R)质粒分别联合空白对照(Vector)/HDAC6质粒转染HEK-293T细胞,分为FLAG-FLOT2(WT)+Vector、FLAG-FLOT2(WT)+HDAC6、FLAG-FLOT2(K211R)+Vector、FLAG-FLOT2(K211R)+HDAC6共4组,分析K211R突变对FLOT2总赖氨酸乙酰化水平的影响.在6-0B细胞中,分别过表达FLOT2(WT)和FLOT2(K211R),用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)、平板克隆形成和Transwell侵袭检测FLOT2乙酰化位点突变体的生物学功能.结果:PhosphoSitePlus数据库显示FLOT2的K211位点存在乙酰化修饰,Co-IP结果证实FLOT2蛋白存在明显的乙酰化修饰,且TSA可以显著上调FLOT2的总乙酰化修饰水平,而NAM则无此作用;K211位点突变后FLOT2的总赖氨酸乙酰化水平显著下降,且不受TSA影响.TSA下调鼻咽癌细胞中FLOT2的蛋白质表达水平,而不影响FLOT2 mRNA的表达水平,也不影响转染FLAG-FLOT2(K211R)的鼻咽癌细胞中FLOT2(K211R)的蛋白质表达水平.FLOT2(K211R)的蛋白质降解速率显著慢于FLOT2(WT)的降解速率.蛋白酶体抑制剂MG132可以阻止TSA引起的FLOT2降解,溶酶体抑制剂CQ则无此功能.BioGrid数据库数据显示FLOT2与HDAC6可能存在相互作用,Co-IP结果证实FLOT2与HDAC6抗体可以相互共沉淀对方蛋白.在敲减HDAC6表达的鼻咽癌细胞中,FLOT2的总赖氨酸乙酰化水平显著提高;共转染HDAC6和FLAG-FLOT2(WT)可显著降低总赖氨酸乙酰化水平,而共转染HDAC6和FLAG-FLOT2(K211R)不影响总赖氨酸乙酰化水平.敲减HDAC6可以显著下调FLOT2的蛋白质水平而不影响其mRNA水平;MG132可以阻止敲减HDAC6引起的FLOT2降解.敲减HDAC6,FLOT2的降解速率显著加快.转染FLOT2(K211R)突变体的鼻咽癌细胞增殖速度和侵袭能力显著强于转染FLOT2(WT)的细胞.结论:FLOT2 K211位点存在乙酰化修饰,HDAC6通过介导FLOT2 K211的去乙酰化修饰抑制FLOT2经蛋白酶体途径降解,维持其在鼻咽癌中的稳定和促瘤功能.

[目的]研究对硝基苯酚(PNP)对大肠杆菌和铜绿假单胞菌产生持留菌的影响,并对转录组进行分析,阐明对硝基苯酚影响持留菌形成的相关机制.[方法]采用氧氟沙星抗生素探究对硝基苯酚对细菌产生持留菌的影响,并通过检测细菌自溶情况和呼吸抑制剂羰酰氰氯苯腙(CCCP)对持留菌比例的影响,然后通过转录组分析其相关基因的表达,最后通过实时荧光定量PCR和反义核酸进行相关功能基因的验证.[结果]PNP可以通过抑制大肠杆菌和铜绿假单胞菌的呼吸作用使其产生持留菌的比例增加,PNP不同浓度、作用不同时间和作用不同生长时期的菌体都会影响细菌产生持留菌的比例.PNP和呼吸抑制剂CCCP均能够抑制2个菌体的自溶情况,包括溶解氧含量的变化、蛋白质降解情况、细胞尺寸的变化和RNA完整性.转录组分析和实时荧光定量PCR实验结果表明加入PNP后,cyoA、appC两个基因在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中的表达量均显著下降,再通过反义核酸抑制cyoA、appC的表达发现持留菌的比例和原始菌株相比均有所增加.[结论]PNP可以通过抑制细胞呼吸作用来增加细菌产生持留菌的比例.

[背景]海洋沉积物中蕴含着丰富的微生物资源,估算约2.9× 1029个细胞,与海水中的微生物总量相当.但是由于缺少可培养物,大部分的微生物缺乏生理特征、代谢方式以及生态功能的相关研究.深古菌(Bathyarchaeota)是一类典型的未培养微生物,在全球海洋沉积物中普遍存在,并且具有很高的丰度.[目的]对深古菌代谢潜能及其在海洋沉积物中发挥的生态功能进行更加深入的研究.[方法]应用宏基因组学的技术手段,对采集自瓜伊马斯盆地的深海热液沉积物样本进行了分析,获得了一个接近完整的深古菌基因组Bathyarchaeota B242.[结果]对Bathyarchaeota B242基因组的分析发现,其具有以降解蛋白质和多种碳水化合物为主的异养代谢途径,同时还具有通过还原型乙酰辅酶A途径实现的自养途径.[结论]同时具有自养和异养代谢途径对Bathyarchaeota B242适应低物质能量供给环境下的生存起到重要作用.

仅-葡糖苷酶以低聚寡糖为底物,通过切割非还原末端α-1,4糖苷键以获得葡萄糖基,同时转苷生成α-1,6糖苷键,广泛应用于低聚异麦芽糖生产、代谢生理研究、疾病预防治疗等各个领域.Aspergillus nidulans来源的α-葡糖苷酶在毕氏酵母中外源表达时存在酶活较低、蛋白质降解等问题,为进一步提高α-葡糖苷酶表达量,共表达N-乙酰转移酶(Mpr1)以降低发酵过程细胞受到的氧化胁迫,提高酶活.以实验室保藏的P.pastoris KM71/pPIC9 K-AgbB为出发菌株,构建共表达菌株Pichia pastoris KM71/pPIC9K-AgbB/pPICZA-Mpr1,经过摇瓶发酵120h,α-葡糖苷酶转苷酶酶活和蛋白质含量可达22.56U/ml和0.52mg/ml,分别是出发菌株摇瓶产酶的1.92倍和1.27倍.在此基础上进行3.6L罐发酵温度和甲醇诱导浓度优化,在25℃,以1％的甲醇浓度诱导发酵最高酶活和蛋白质含量可达128.12U/ml和1.81 mg/ml,分别是起始菌株上罐产酶的1.96倍和1.50倍.

水产品是优质蛋白的重要来源之一,但其极易受到微生物侵染而导致蛋白质降解,产生腥臭味等品质劣变现象,从而使感官可接受度下降,该问题已成为我国水产行业发展的制约因素之一.水产品的腐败变质往往是多种微生物共同作用的结果.在水产品贮藏过程中,菌群通过相互协作或竞争等作用推动菌群的演替、优势菌群的形成以及水产品的腐败进程.本文中,笔者综述了水产品中常见的腐败微生物种类及其对水产品腐败的影响,重点阐述多种微生物之间的相互作用及群体感应现象的研究现状,旨在为水产品保鲜技术研究与开发提供参考.

断裂内含肽Npu DnaE介导的蛋白质剪接、剪切反应,可以应用于蛋白质工程领域诸多方面,但其C段重组蛋白在表达纯化过程中发生的降解,降低了重组蛋白的产率和纯度.为提高NpuC段稳定性,本研究构建了N端融合NpuN2片段的NpuC延长变体N2C.将N2C在BL21(DE3)中进行表达、用亲和色谱进行纯化,用ImageJ扫描计算表达纯化中降解情况,进而对影响内含肽C端剪切反应的各因素如温度、DTT浓度、N/C比例等进行了考察.结果表明,延长变体N2C使降解产物占比降低至2.7％～7.2％,在1 mmol/L DTT催化,N/C比例为5:1,37℃反应条件下,30 min产物生成率达90％.N2C在提升Npu DnaE内含肽C段在大肠埃希菌表达系统中表达、纯化过程的稳定性的同时,保留了其C端剪切反应的活性,对其在蛋白纯化领域应用有重要意义.

目的:本研究通过对高温蛋白质降解菌的富集培养、筛选与分离,旨在为鸡粪资源的合理利用,生产高质量的有机肥料奠定基础.方法:通过在高温条件下对高效降解蛋白质的高温菌种进行富集培养、纯化与分离.结果:分离得到24株高温高效降解蛋白质菌株,经鉴定其分别属于短短芽孢杆菌属(Brevibacillus spp.)、嗜热芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、假黄单孢菌(Pseudoxanthomonas spp.)等8种菌属.将制备的复合菌液接种于鸡粪中发现,实验组升温速率明显快于对照组,在发酵后16h左右到达高温阶段,比空白组提前将近8h,且加入耐高温蛋白质降解菌的FJ3组,高温期比空白组延长24 h左右,持续时间长达56 h;发酵过程pH值比空白组下降较快,pH值最低到5.5左右;物料的含水率从65％降至20％左右,N、P、K等营养元素所占比例有所增加,且发酵产物质地松散、柔软,带有较浓的酸香味.结论:实验表明添加外源高温降解蛋白质菌株,能够减少鸡粪发酵产生的恶臭,活化养分,提高堆肥效果,对鸡粪便的处理有重要意义.

以体外H2O2耐受能力为指标,从自然界获取1株在6 mmol/L H2O2下仍能缓慢生长的野生酵母,命名为NCY33.菌体密度为108 cfu/mL的完整菌体对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)清除率为38.60％±1.91％,抗脂质过氧化率为67.15％±3.22％.通过内转录间隔(ITS)序列分析进行菌种鉴定发现,该酵母为汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii).利用RNA-seq技术对氧化胁迫下该酵母转录谱进行测序并分析,结果表明:该酵母耐受4 mmol/L H2O2诱导的氧化胁迫是一个多基因参与、多个生物过程协同调控的过程,尤其以物质代谢途径、DNA修复、蛋白质降解以及多个抗氧化酶变化最为明显.

目的 探讨WW结构域的E3泛素蛋白连接酶1(WWP1)和E3泛素蛋白连接酶2(WWP2)对3种转录因子[八聚体结合转录因子4(OCT4)、性别决定区Y-box蛋白2(SOX2)和NANOG蛋白]水平的影响.方法 通过质粒转染,在HEK 293FT细胞中分别共表达OCT4、SOX2、NANOG和WWP1或WWP2.通过免疫印迹法检测WWP1或WWP2过表达对OCT4、SOX2、NANOG蛋白水平的影响.通过GST pull-down实验和免疫共沉淀实验分析WWP1与SOX2蛋白间的相互作用;运用体外蛋白质泛素化修饰实验证明WWP1是否为SOX2的特异E3泛素连接酶.结果 在WWP1与OCT4、WWP1与SOX2及WWP2与OCT4共表达体系中,WWP1或WWP2均呈剂量依赖性地下调对应的共表达蛋白OCT4或SOX2水平,且以WWP1与SOX2共表达体系中SOX2蛋白的表达下调最为明显.在其他共表达体系中,WWP1或WWP2对对应的共表达蛋白均无明显的下调作用.溶酶体抑制剂氯喹可部分阻止SOX2蛋白水平的降低.放线菌酮(CHX)处理24 h后,WWP1与SOX2共表达体系中的SOX2蛋白水平的下降速度快于单独过表达SOX2(P<0.05).WWP1可以通过与SOX2蛋白的直接相互作用催化SOX2蛋白的泛素化修饰.结论 WWP1是SOX2蛋白新的E3泛素连接酶,可促进SOX2蛋白经泛素-溶酶体途径降解,进而下调SOX2蛋白的表达.