[目的]将已获得的中华蜜蜂Apis cerana cerana转录组纳米孔长读段数据比对到东方蜜蜂A.cerana参考基因组,进行注释基因的结构优化,鉴定未注释的新基因和新转录本并进行功能注释以及预测其SSR位点、完整ORF和转录因子(transcription factor,TF)家族及成员的分析验证,完善现有的东方蜜蜂参考基因组序列和功能注释.[方法]基于已获得的高质量的接种蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis的中华蜜蜂工蜂4,5和6日龄幼虫肠道转录组纳米孔测序数据,使用gffcompare软件将已鉴定到的全长转录本比对到东方蜜蜂参考基因组以优化已注释基因的结构;采用gffcompare软件鉴定参考基因组上未注释的新基因和新转录本,再通过比对Nr,KOG,eggNOG,GO和KEGG数据库进行功能注释;使用MISA,TransDecoder v3.0.0和animalTFDB 2.0软件分别预测SSR位点、完整ORF和TF家族及成员.[结果]共对东方蜜蜂参考基因组上已注释的4 648个基因结构进行了优化,对1 336个基因同时延长了 5'UTR和3'UTR,分别延长了 1 688个基因的5'UTR和1 624个基因的3'UTR;共鉴定到2 148个新基因,其中分别有818,298,587,359和333个新基因可注释到Nr,KOG,eggNOG,GO和KEGG数据库;共鉴定到35 432条新转录本,其中分别有30 974,21 222,29 025,19 852和9 214条新转录本可注释到上述5个数据库;共发掘出22 541个SSR位点,其中单、双、三和六碱基重复的SSR数量分别为12 078,7 140,2 825和43个,混合SSR的数量为2 964个,分布频率最高的类型是单碱基重复(153.37个/Mb);共预测到58个TF家族及1 611个成员;共预测出28 775个完整ORF,其中编码长度分布在100～200个氨基酸的ORF(38.99％)最多.[结论]研究结果优化了东方蜜蜂参考基因组上已注释基因的结构,并补充了参考基因组上未注释的新基因、新转录本、SSR、完整ORF及TF.

[目的]通过纳米孔(nanopore)测序技术组装和注释中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂幼虫肠道高质量全长转录组.[方法]采用Nanopore PromethION系统对蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis接种的中华蜜蜂工蜂3日龄幼虫后的4,5和6日龄幼虫肠道(分别为AcT4,AcT5和AcT6)进行转录组测序,鉴定全长转录本序列;将前期未接种蜜蜂球囊菌中华蜜蜂工蜂4,5和6日龄幼虫肠道转录组纳米孔测序数据中鉴定到的全长转录本与上述鉴定到的全长转录本混合后滤除冗余全长转录本;将鉴定到的非冗余全长转录本比对Nr,KOG,eggNOG和GO数据库进行注释.采用CPC,CNCI,CPAT和Pfam 4种方法预测长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA).[结果]AcT4,AcT5 和 AcT6 分别测得 14 474 634,10 461 827 和 11 890 978 条原始读段(raw reads),分别包含11 898 582,8 630 186和9 091 035条全长转录本,去冗余后分别鉴定到27 815,21 781和20 004条非冗余全长转录本,N50长度分别为1 900,1 961和2 294 bp,平均长度分别为1 534,1 584和1 792 bp,最长读段长度分别为10 855,10 837和10 887 bp.鉴定到40 562条去非冗余全长转录本,分别有35 415,24 646,34 054和23 053条转录本可分别注释到Nr,KOG,eggNOG和GO数据库.在Nr数据库中注释全长转录本数目和占比最高的物种是东方蜜蜂A.cerana(20 310条,57.35％),其次为西方蜜蜂4.mellifera(4 686条转录本,占13.23％)、大蜜蜂A.dorsata(2 536条转录本,占7.16％)和小蜜蜂A.florea(2 079条转录本,占5.87％).非冗余全长转录本可注释到eggNOG数据库中的未知功能及翻译后修饰、蛋白质更新和分子伴侣等25个功能分类、KOG数据库中的仅一般功能预测和信号转导机制等25个功能分类、GO数据库中生物学进程、细胞组分和分子功能三大类中的50个功能条目以及KEGG数据库中核糖体和RNA转运等196条通路.共鉴定到2 301条高可信度lncRNA,涉及正义链lncRNA、反义链lncRNA、内含子lncRNA和基因间区lncRNA 4种类型.[结论]成功构建和注释了中华蜜蜂工蜂幼虫肠道的首个全长转录组,为中华蜜蜂和东方蜜蜂A.cerana其他亚种的分子生物学及组学研究提供了高质量参考背景和关键基础.

[背景]球囊菌是一种典型的蜜蜂真菌性病原,特异性地侵染蜜蜂幼虫.目前,有关球囊菌在侵染过程中的基因表达规律的信息极为有限.[目的]通过深入分析胁迫意大利蜜蜂(意蜂)幼虫肠道的球囊菌及其纯培养的高表达基因(HEGs)差异,探索球囊菌在胁迫意蜂幼虫肠道后期与胁迫前的基因表达规律.[方法]利用RNA-Seq技术对球囊菌胁迫的意蜂6日龄幼虫肠道(AamT)及球囊菌纯培养(AaCK)进行深度测序,根据FPKM值筛选得到球囊菌的HEGs,进而通过GO (Gene ontology)及KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析、Venn 分析对上述HEGs进行功能预测和生物学意义挖掘.[结果]AaCK与AamT的转录组测序共得到105 447 578条原始读段(Raw reads),经过滤得到88 466 344条有效读段(Clean reads),两端平均Q20为97.50％,平均Q30为93.81％.GO富集分析结果显示,AaCK的HEGs富集于26个GO terms,基因富集数最多的是细胞(22 Unigenes),其次是细胞组件(22 Unigenes)和代谢过程(21 Unigenes);AamT的HEGs富集于22个GO terms,基因富集数最多的是催化活性(23 Unigenes),其次是细胞进程(18 Unigenes)和代谢过程(18 Unigenes). KEGG代谢通路(Pathway)富集分析显示,AaCK的HEGs 富集在109个Pathways上,基因富集数最多的是核糖体(179 Unigenes),其次是氨基酸生物合成(70 Unigenes)和碳代谢(62 Unigenes);AamT的HEGs富集在1 14个Pathways上,基因富集数量最多的是核糖体(178 Unigenes),其次是碳代谢(116 Unigenes)和氧化磷酸化(112 Unigenes). Venn分析结果显示,AaCK与AamT共有的HEGs有260个,二者特有的HEGs分别为2 161个和4 445个.[结论]提供了胁迫意蜂6日龄幼虫肠道的球囊菌及其纯培养的HEGs表达谱,揭示了球囊菌在胁迫前和胁迫后期的基因表达规律,也为阐明球囊菌致病的分子机理提供了有益的信息和线索.

[目的]本研究利用small RNA-seq技术对球囊菌的纯培养进行测序,对球囊菌的microRNAs miRNAs)进行预测、鉴定和分析,进而构建miRNAs-mRNAs的调控网络.[方法]利用Illumina Hiseq Xten 平台对球囊菌菌丝与孢子进行测序,通过相关生物信息学软件对球囊菌的miRNAs进行预测和分析,通过茎环(Stem-loop) PCR对部分miRNAs进行鉴定,利用Cytoskype软件构建miRNAs-mRNAs的调控网络.[结果]本研究共获得48268696条clean reads,预测出118个球囊菌的miRNAs,它们的长度分布介于18-25 nt之间,不同长度的miRNA的首位碱基偏好性差异明显.Stem-loop PCR验证结果显示共有10个miRNAs能够扩增出符合预期的目的片段,说明多数miRNAs可能真实存在.共预测出6529个球囊菌miRNAs的靶基因,其中5725个能够注释到Nr、Swissprot、KOG、GO和KEGG数据库.进一步分析结果显示有24个靶基因注释在MAPK信号通路.Cytoskype软件分析结果显示球囊菌的miRNAs与mRNAs之间存在复杂的调控网络,绝大多数的miRNAs处于调控网络的内部且同时结合多个mRNAs.[结论]本研究率先对球囊菌的miRNAs及miRNAs-mRNAs调控网络进行全面分析,研究结果丰富了对球囊菌miRNAs的认识,为其基础生物学信息提供了有益补充,也为阐明球囊菌致病的分子机理打下了一定基础.

[目的]蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis(简称球囊菌)是一种特异性侵染蜜蜂幼虫肠道的致死性真菌病原.微小RNA(microRNA,miRNA)是一种在转录后水平对mRNA进行负调控的关键调控因子.本研究旨在对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称意蜂)幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的差异表达miRNAs(DEmiRNAs)及其靶基因进行深入分析,为揭示DEmiRNAs在胁迫应答中的作用提供重要信息.[方法]利用small RNA-seq (sRNA-seq)技术对正常及球囊菌侵染的意蜂6日龄幼虫肠道(分别表示为AmCK和AmT)进行测序,通过相关生物信息学软件对DEmiRNAs进行预测和分析.利用TargetFinder软件预测DEmiRNAs的靶基因,然后利用Blast软件对靶基因进行GO和KEGG数据库的功能注释.通过Cytoscape软件构建DEmiRNAs与其靶mRNAs的调控网络.通过茎环实时荧光定量PCR(stem-loop RT-qPCR)验证测序数据的可靠性.[结果]AmCK和AmT的测序分别得到9 230 496和10 823 667条有效序列标签;AmCKvsAmT比较组中包含15个上调和6个下调miRNAs,分别结合3 503和3 252个靶基因,它们可分别注释到40和39个GO terms以及104和99条代谢通路;进一步分析发现调控网络中的17个DEmiRNAs靶向结合116个与丝氨酸蛋白酶相关的mRNAs,14个DEmiRNAs靶向结合54个与泛素介导的蛋白水解相关的mRNAs.Stemloop RT-qPCR验证结果显示随机选择的4个DEmiRNAs(miR-251-x,miR-9277-y,miR-1672-x和miR-4968-y)的表达量变化趋势与测序结果一致,表明测序数据真实可信.[结论]本研究率先对意蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的DEmiRNAs及其靶基因进行预测与分析,提供了miRNAs的表达谱和差异表达信息.ame-miR-927b,miR-429-y和miR-8440-y等DEmiRNAs可能参与对丝氨酸蛋白酶的调控和对泛素介导的蛋白水解的调控,DEmiRNAs与靶基因之间存在复杂的调控网络关系.DEmiRNAs可参与到意蜂幼虫肠道与球囊菌间的互作.

[目的]蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)是一种能够侵染中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫的致死性真菌病原.微小RNA (microRNA,miRNA)可通过在转录后水平靶向抑制或降解mRNA而参与宿主与病原互作过程.本研究旨在对球囊菌胁迫的中蜂6日龄幼虫肠道的差异表达miRNA (DEmiRNA)及其靶基因进行深入分析,进而揭示DEmiRNA在中蜂响应球囊菌胁迫应答过程中的作用.[方法]利用Illumina MiSeq平台对正常及球囊菌胁迫的中蜂6日龄幼虫肠道(AcCK和AcT)进行测序,通过相关生物信息学软件预测DEmiRNA及其靶基因.通过Blast将靶基因注释到GO和KEGG数据库.利用Cytoscape软件构建DEmiRNA与其靶mRNA的调控网络.通过Stem-loop RT-PCR和qPCR验证测序数据的可靠性.[结果]本研究共预测出537个miRNA,其长度分布介于16-35 nt之间,且不同长度的miRNA首位碱基偏向性差异明显.通过Stem-loop RT-PCR证实了10个novel miRNA的表达.AcCK vs AcT比较组共有54个DEmiRNA,包含3 1个上调和23个下调miRNA,可分别靶向结合6170和8199个靶基因.GO分类结果显示上调和下调miRNA的靶基因分别涉及47和47个条目,富集基因数最多的皆为结合细胞进程和催化活性.KEGG代谢通路(pathway)富集分析结果表明上调和下调miRNA的靶基因分别富集在134和126条pathway,富集基因数最多的均为内吞作用和内质网中的蛋白质加工.调控网络分析结果表明,DEmiRNA及其靶mRNA形成十分复杂的调控关系;31个DEmiRNA可靶向结合51个与泛素介导的蛋白水解相关的mRNA,18个DEmiRNA可靶向结合14个与Jak-STAT信号通路相关的mRNA;miR-1277-x、miR-26-x、miR-27-y、miR-30-x、miR-6052-x等16个miRNA共同参与了上述两条免疫通路的调控.最后,随机挑选3个DEmiRNA进行qPCR验证,结果证明了测序数据的可靠性.[结论]本研究提供了中蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的miRNA的表达谱和差异表达信息,揭示了球囊菌与宿主之间在miRNA组学水平存在复杂的互作.miR-6052-x和miR-1277-x作为调控网络的核心可能通过影响细胞凋亡参与宿主的免疫防御,miR-26-x和miR-30-x可能通过调控Jak-STAT信号通路参与宿主的胁迫应答.本研究筛选出的关键DEmiRNA有望作为治疗白垩病的分子靶标.

[目的]蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)是专性侵染蜜蜂幼虫的致死性真菌病原.MicroRNA(miRNA)作为一类重要的基因表达调控因子,能够广泛参与真菌及其宿主的相互作用过程.本研究通过比较分析球囊菌孢子(AaCK)和侵染中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)6日龄幼虫肠道内的球囊菌(AaT)的small RNA (sRNA)组学数据对球囊菌的差异表达miRNA (differentially expressed miRNA,DEmiRNA)、靶mRNA及二者间的调控网络进行全面解析,旨在揭示miRNA介导的球囊菌对中蜂幼虫的侵染机制.[方法]对于球囊菌侵染的中蜂6日龄幼虫肠道的small RNA-seq (sRNA-seq)数据,利用BLAST工具连续比对东方蜜蜂(Apis cerana)和球囊菌的参考基因组筛滤得到AaT的sRNA组学数据.分别将AaCK和AaT的sRNA组学数据比对miRBase数据库,对球囊菌侵染宿主前后miRNA的数量和结构特征进行分析.联用RNAhybrid+svm_light、Miranda和TargetScan软件预测AaCK vs AaT比较组中DEmiRNA的靶mRNA,进而利用相关生物信息学软件对上述靶mRNA进行GO分类和KEGG代谢通路富集分析.通过Cytoscape软件对DEmiRNA-mRNA调控网络进行可视化.利用Stem-loop RT-PCR、RT-qPCR和分子克隆验证测序结果的可靠性.[结果]在AaCK和AaT中分别鉴定到380和387个miRNA.结构特征分析结果显示,AaCK和AaT的miRNA皆集中分布在18-25 nt,且首位碱基主要偏向于U.AaCK vs AaT比较组共有270个DEmiRNA,包含155个上调miRNA和115个下调miRNA,分别靶向结合6091和6145个mRNA.GO分类结果显示,上述靶mRNA主要涉及代谢进程、细胞进程、应激反应等15个生物学进程;细胞、细胞组分、细胞器等12个细胞组分;催化活性、结合、转运子活性等11个分子功能.KEGG代谢通路富集分析结果显示,上述靶mRNA富集在123条代谢通路,参与对氨基酸代谢、碳水化合物代谢以及核苷酸代谢等物质代谢,氧化磷酸化、硫代谢、氮代谢等能量代谢,以及MAPK和Hippo等信号通路的调控.球囊菌DEmiRNA与靶mRNA之间存在复杂的调控关系,其中miR-29-x、miR-250-x、miR-4968-y、miR-11200-x、novel-m0023-5p、novel-m0130-5p和novel-m0135-5p等DEmiRNA可靶向结合与球囊菌的半胱氨酸蛋白酶、DNA甲基化转移酶以及几丁质酶相关的mRNA;此外,miR-7-x、miR-9-z、miR-319-y和miR-5951-y等同时参与调控MAPK信号通路;进一步分析发现,miR-250-x同时参与对DNA甲基化转移酶、MAPK信号通路及其他酶类合成与代谢途径的调控,并可能参与球囊菌与中蜂6日龄幼虫之间的跨界调控.通过Stem-loop RT-PCR和RT-qPCR验证了4个DEmiRNA的差异表达,并利用分子克隆和Sanger测序证实miR-7-x的序列与测序结果一致.[结论]本研究解析了侵染中蜂6日龄幼虫的球囊菌的miRNA差异表达谱及DEmiRNA的调控网络,揭示了球囊菌DEmiRNA可能通过调控病原的物质和能量代谢、增殖、毒力、信号通路及相关mRNA参与对中蜂幼虫的侵染过程.miR-7-x、miR-250-x、novel-m0023-5p等关键DEmiRNA有望作为白垩病治疗的新型分子靶点.

[目的]筛选验证意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica染色体DNA非编码区与抗白垩病相关的SNP.[方法]本研究将蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis孢子接种于人工饲养的意大利蜜蜂3日龄幼虫,根据是否存在白垩病症状进而筛选出抗病个体和易感个体.基于前期重测序结果中意大利蜜蜂第2和11号染色体DNA非编区与抗白垩病相关的SNP信息,利用PCR测序的方法筛选并验证意大利蜜蜂幼虫第2和11号染色体DNA非编码区与幼虫抗白垩病相关的55个SNP.[结果]发现位于意大利蜜蜂第11号染色体LOC1 00578413基因5'端的非编码区的SNP(T14570310C)在抗病个体中T等位基因频率高于C等位基因频率,且抗病个体中的T等位基因频率显著高于易感幼虫中的T等位基因频率,表明该SNP位点与抗白垩病相关.该分子标记对抗性个体和易感个体的判断结果与前期筛选的编码区SNP(C2587245T)分子标记的结果一致.[结论]筛选并验证意大利蜜蜂第11号染色体DNA非编码区的SNP(T14570310C)与抗白垩病相关.该位点为抗白垩病分子辅助选育提供新的分子标记,在意大利蜜蜂白垩病早期检测和培育白垩病抗性的蜂种方面具有重要意义.

[目的]蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)专性侵染蜜蜂幼虫而导致白垩病,危害蜜蜂健康和养蜂生产.本研究旨在探究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)6日龄幼虫响应球囊菌胁迫的环状RNA(circular RNA,circRNA)差异表达谱及差异表达circRNA (differentially expressed circRNA,DEcircRNA)在宿主胁迫应答中的潜在功能.[方法]利用去除线性RNA的circRNA-seq技术对正常和球囊菌侵染的中蜂6日龄幼虫肠道(AcCK和AcT)进行测序.利用find circ软件鉴定circRNA,统计circRNA的长度和环化类型.根据|log2(Fold change)|≥1和P≤0.05的标准筛选DEcircRNA.将DEcircRNA的来源基因比对Gene ontology (GO)数据库和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)数据库,从而获得功能及通路(pathway)注释.随机挑选3个DEcircRNA进行RT-qPCR验证.[结果]AcCK和AcT的circRNA-seq分别得到76342570和68269362条原始读段(raw reads),经严格质控得到74524108和66974392条有效读段(clean reads),Q30分别为92.75％和94％,GC含量分别为54.31％和54.90％.比对上东方蜜蜂(Apis cerana)参考基因组的短序列读段(anchor reads)共计23648400条.AcCK和AcT中分别鉴定到805和702个circRNA,长度均介于201-1000 nt,数量最多的环化类型均为已注释外显子circRNA,但分布在不同长度、不同环化类型的circRNA数量存在差异.AcCK vs AcT比较组共有494个DEcircRNA,包括257个上调circRNA和237个下调circRNA;上调和下调幅度最大的circRNA分别为novel_circ_-000123和novel_circ_000726.上述DEcircRNA的来源基因可注释到11条生物学进程相关条目,9条分子功能相关条目,9条细胞组分相关条目,以及73条通路.进一步分析发现,部分DEcircRNA的来源基因注释到7条细胞免疫通路和3条体液免疫通路.[结论]中蜂6日龄幼虫响应球囊菌胁迫的过程中可能通过改变分布在不同长度和环化类型的circRNA数量,以及特异性表达一些circRNA和调节部分circRNA的表达量对病原产生应答;novel_ circ_ 000027、novel_ circ_ 000127、novel_ circ_ 000312等DEcircRNA在宿主的胁迫应答过程中可能通过调控氧化磷酸化、细胞和体液免疫等通路发挥特殊作用.研究结果为深入理解中蜂幼虫对球囊菌的胁迫应答机制及二者的相互作用机制提供了新见解.

[目的]利用已获得的纳米孔长读段测序数据完善现有的蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis参考基因组注释信息,并对未注释的新基因和新转录本进行鉴定和功能注释.[方法]基于已获得的纳米孔长读段测序数据,采用gffcompare软件将蜜蜂球囊菌全长转录本与参考基因组注释的转录本进行比较,进而对参考基因组注释基因的非翻译区(untranslated region,UTR)进行延长.利用TransDecoder软件对蜜蜂球囊菌基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)及相应的氨基酸序列进行预测.通过MISA软件发掘长度在500 bp以上的全长转录本的SSR位点.通过Blast工具将鉴定到的新基因和新转录本比对Nr,KOG,eggNOG,Swiss-Prot,Pfam,GO和KEGG数据库进行功能注释.[结果]共对蜜蜂球囊菌的9 481个基因进行了UTR延长,其中5'UTR和3'UTR延长的基因分别有4 744和4 737个.共预测出10 492个完整ORF,其中编码长度分布在0～100和100～200个氨基酸的ORF最多,分别占ORF总数的38.96％和36.90％.共鉴定到5 286个SSR,其中单核苷酸重复、二核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、五核苷酸重复和六核苷酸重复的SSR分别为1 870,826,2 398,138,43和11个.共鉴定到1 558个新基因,其中有1 556,731,330,592,1 177,709和589个新基因可分别被注释到Nr,Swiss-Prot,Pfam,KOG,eggNOG,GO和KEGG数据库.此外,还鉴定到14 403条新转录本,其中有14 376,8 524,7 276,7 405,12 035,7 891和6 855条新转录本可分别被注释到上述7个数据库.[结论]本研究利用已获得的纳米孔长读段测序数据对蜜蜂球囊菌的完整ORF进行了预测,对参考基因组的已注释基因进行了UTR延长,对未注释的SSR位点进行了发掘,此外还鉴定到大量未注释的新基因和新转录本,并对它们进行了功能注释.研究结果较好地完善了现有的蜜蜂球囊菌的基因组注释,为其组学和分子生物学研究的深入开展提供了基础.