目的:对比呼吸道合胞病毒(RSV)融合前F蛋白(PreF)和融合后F蛋白(PostF)的免疫原性差异。方法:通过SDS-PAGE及Western blot鉴定PreF和PostF的表达，使用Octet仪器检测F蛋白与特异性抗体的亲和力，用PreF和PostF免疫小鼠，检测免疫血清的结合抗体与中和抗体差异。结果:PreF经改造后以稳定的三聚体形式存在，与单抗D25、8897、AM14、Palivizumab以及Motavizumab均具有很高的亲和力，但PostF缺乏表位?构象，并呈现单体构象，与D25、8897、AM14并无明显结合。PreF和PostF免疫小鼠的研究发现，AS01佐剂比铝佐剂更能诱导出高滴度结合抗体和针对RSV Long株的中和抗体。PreF与PostF免疫后诱导的结合抗体与PreF的结合能力相当，PostF免疫后诱导的结合抗体与PostF的结合水平显著高于PreF。结论:PreF拥有更多的抗体结合表位，改造后稳定的PreF三聚体重组蛋白能够诱导更强的中和抗体。同时，AS01佐剂免疫效果优于铝佐剂。因此，基于PreF稳定的三聚体结构改造及佐剂的研发对于RSV疫苗的发展至关重要。

目的 建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)融合前F蛋白(prefusion F protein,pre-F)三聚体定量检测方法,并对其进行方法学验证和初步应用.方法 选取RSV pre-F三聚体特异性抗体AM14 作为捕获抗体,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的RSV pre-F特异性抗体D25 作为检测抗体,通过方阵滴定法确定捕获抗体和检测抗体的最佳浓度,对封闭液进行优化,建立双抗体夹心ELISA.分别对该方法的专属性、准确度、精密度和耐用性进行验证,并应用于RSV亚单位疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测.结果 该方法确定的捕获抗体AM14 包被浓度为 1.25 μg/mL,检测抗体D25 浓度为0.50 μg/mL,封闭液为1%牛血清白蛋白(bo-vine serum albumin,BSA).方法验证结果显示,线性范围为 1.50～24.00 ng/mL,标准曲线R2>0.99,最低检测限可达1.33 ng/mL;该方法专属性良好,仅与RSV pre-F三聚体反应;准确度和精密度验证结果显示回收率为 87.41%～117.03%,变异系数(coefficient of variation,CV)为 5.47%～14.07%;检测抗体孵育时间及显色时间在一定范围内波动时,回收率在 87.65%～106.45%,证明该方法耐用性优良;该方法可应用于RSV pre-F发酵和纯化等样品的检测.结论 成功建立并验证RSV pre-F三聚体定量检测方法,该方法专属性强,准确度、精密度、耐用性均优良,可应用于RSV疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测,无需Octet或者Biacore等精密仪器,具有操作简单、定量准确、成本低、便于推广应用等优点.

目的 筛选并构建成功表达A亚型人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,HRSV)融合前构象F蛋白的重组人5型腺病毒(Recombinant Human type5 adenovirus,rHADV-5),为制备和研发HRSV重组腺病毒载体疫苗奠定基础.方法 在真核表达载体pcDNA3.1(+)上插入具有不同突变位点的HRSV F蛋白编码序列,利用融合前F蛋白单克隆抗体AM14和D25筛选HRSV F蛋白突变体;通过同源重组将筛选出的前构象F蛋白突变体编码序列插入非复制型人5型腺病毒载体,在HEK293细胞中进行重组病毒的包装和扩增,经氯化铯密度梯度法获得纯化的重组病毒;应用夹心ELISA法和Western blot鉴定F蛋白的表达及构象.结果 通过AM14和D25单克隆抗体筛选出了 2个稳定维持在融和前构象的HRSV F蛋白序列(SC-3M和SC-5M).将SC-3M和SC-5M编码序列插入非复制型人5型腺病毒载体,对两种重组人5型腺病毒(pAd5-SC-3M 和 pAd5-SC-5M)和空载体(pAd5-vector)纯化,病毒滴度分别达到 2.016 × 1010,2.52 × 1010和 2.948× 1011 IU/mL.pAd5-SC-3M和pAd5-SC-5M感染HEK293后均能高效表达HRSV融合前构象的F蛋白并维持三聚体结构,且pAd5-SC-5M感染细胞中F蛋白表达量高于pAd5-SC-3M.结论 成功在体外传代细胞中获得可高效表达A型HRSV融合前F蛋白的重组人5型腺病毒,为进一步通过动物试验评价该HRSV重组腺病毒载体疫苗奠定了基础.

躯体感觉涉及的细胞类型多并且环路复杂,因此,保证神经元所处的生理环境,从群体水平观察神经元的活动非常重要.近年来,随着敏感的基因编码的钙离子指示剂(GECIs)的发展,科学家们可以同时监测群体细胞中瞬时的Ca2+变化,从而间接的观察神经元的电活动.本篇综述主要介绍:在体DRG钙成像(In vivo DRG calcium imaging)在疼痛外周机制研究中的应用.GCaMP,属于GECIs的一员,由绿色荧光蛋白(GFP)、钙调蛋白(CaM)和肌球蛋白轻链激酶(M13)融合而成.当Ca2+缺少时,荧光蛋白处于极弱的荧光状态.当Ca2+结合CaM时,CaM发生构象变化,其铰链区可以结合M13,致使GFP发出强烈的荧光.通过构建Pirt-GCaMP3小鼠,使得GCaMP3在伤害性神经元中表达,科学家可以利用在体DRG钙成像的方法,深入研究疼痛传递的外周机制.使用这种方法,科学家们可以同时观察大量的DRG神经元中Ca2+的瞬时变化(>1600神经元 / DRG神经元,约总DRG神经元的15%).进一步研究发现,损伤之后,神经元之间通过缝隙连接的耦合(couping)度增加.这种耦合现象可以发生在不同直径的神经元之间,如大直径神经元(传递非伤害性信息)和小直径神经元(传递伤害性信息)之间.因此,非伤害性刺激在激活大直径神经元的同时,还可以激活小直径神经元,从而导致机械痛敏.另外,炎症刺激可以明显增加对机械刺激有反应的DRG神经元的数量.除了DRG以外,目前该技术还用于脊髓的研究.以GCaMP为新型钙离子指示剂的在体DRG钙成像技术,在保证初级感觉神经元系统生物完整性的状态下,同时监测大量的神经元的活动,将帮助科学家们深入研究疼痛的机制.

呼吸道合胞病毒( RSV)是儿童和老年人严重呼吸道感染的主要病原体,且没有市售的疫苗.在此研究中,作者研制和分析了以基因组复制缺陷的新型仙台病毒( SeV)载体为基础的RSV的亚单位疫苗. 作者将已知的基因稳定的抗原RSV F蛋白以特定的方式插入其载体中以优化疫苗的特性. 通过将RSV F蛋白的胞外域与SeV中它的相对物进行交换,作者构建了一种嵌合载体疫苗,其包含作为必需结构成分的RSV F蛋白. 用这种方式将抗原以其融合前的构象在疫苗颗粒的表面上积极地表达,并且如最近报道的其他载体疫苗那样,疫苗基因组中转基因沉默突变的发生可以被制止. 此外,基因的积极表达有助于刺激更多的免疫应答.

趋化因子受体5 (CCR5) 能介导HIV-1与细胞膜的融合, 是HIV-1入侵细胞的主要辅助受体之一.CCR5拮抗剂可与其结合, 致CCR5发生构象变化从而阻断HIV-1感染.目前已筛选出多个活性强且耐受性好的小分子CCR5拮抗剂并进入了临床试验阶段.随着CCR5拮抗剂的广泛使用, 病毒耐药性也逐渐产生, 且已有不少关于此类药物相关的体内外抗病毒治疗失败的研究报道.本文就CCR5如何介导HIV感染细胞机制、目前已上市的马拉维诺和其他进入临床试验的小分子CCR5拮抗剂研发现状及其耐药性研究进展进行综述.

利用免疫沉淀、免疫印迹及cDNA克隆与分子测序等技术已测定出寻常型天疱疮抗原、落叶性天疱疮抗原分别为桥粒芯蛋白。已用基因工程技术合成了天疱疮抗原的细菌融合蛋白与具备天然立体构象的由真核细胞产生的抗原重组蛋白,由此对抗原表位及天然立体构象进行了深入的研究。本文综述了各型天疱疮抗原的研究结果及目前有争议及尚待研究的问题。

急性硬膜下血肿(acute subdural hematomas,ASDH)是创伤性颅脑损伤的继发性损伤[1],临床救治存在很多挑战[2],静脉损伤在其致病机制中可能存在一定作用[3].以往ASDH的影像学评估通常由CT平扫来实现,缺乏脑静脉损伤的评估.近年来,颅脑CT静脉成像(computed tomographic venography,CTV)技术逐渐成熟[4],CTV后处理的容积重建技术(volume rendering technique,VRT)能显示脑静脉的整体形态,已成为重要的影像解剖学评估依据[5],VRT结合图像融合技术已被用于颅内肿瘤及颅内静脉畸形的术前评估中[6,7],并用于指导复杂的肺段切除[8],CTV曲面重建技术(curved plannar reconstruction,CPR)已用于心脏血管的测量和评估[9].目前鲜见这些静脉显像技术应用于ASDH患者,因此本文展开初步技术探索,并进行相关影像解剖观察.

目的 分析呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F蛋白融合前、融合后构象及其三聚体;比较不同细胞表达的融合前RSV F蛋白(Pre-F)的活性.方法 分别构建和制备含有Pre-F和融合后RSV F蛋白(Post-F)基因的重组质粒,转染Xten293或者XtenCHO细胞后,收获上清进行蛋白纯化.然后,利用融合前特异性抗体D25和AM14通过Western blotting和ELISA对纯化后的RSV F蛋白进行融合前、融合后构象验证和聚体分析,并对不同细胞表达的Pre-F与抗体的结合活性进行比较.结果 成功构建并转染了含有Pre-F和Post-F基因的重组质粒;收获后的上清经His标签纯化获得了纯度较高的目的蛋白;经SDS-PAGE分析显示,在变性还原条件下,RSV F蛋白裂解为F2和F1两个蛋白.Western blotting和ELISA检测结果显示,只有Pre-F可以与D25抗体发生特异性反应,而Post-F与D25抗体不发生特异性反应.Pre-F和Post-F聚体构象分析表明,在变性非还原条件下,RSV F蛋白主要以单体的形式存在;Native-PAGE检测结果证实,两种构象的RSV F蛋白均以三聚体的形式存在;Western blotting和ELISA检测结果显示,只有Pre-F三聚体能与AM14抗体特异性结合.此外,不同细胞表达的Pre-F与D25和AM14抗体的结合活性不同,其中Xten293细胞表达的Pre-F与D25和AM14抗体的结合活性更高.结论 成功分析了Pre-F和Post-F的构象,并对两种构象的RSV F蛋白三聚体活性进行了验证和比较,这些将为今后RSV F蛋白亚单位疫苗研发中质量控制方法的建立提供数据参考.

相比传统小分子药物,重组蛋白药物具有高活性、高特异性和低毒性等多种独特优势,但囿于机体内蛋白水解、肾脏消除、肝脏代谢以及免疫清除等影响,往往导致重组蛋白药物的体内半衰期短,使用受限,显然,蛋白长效化处理策略对于重组蛋白药物的发展十分必要.延长半衰期的基本策略是结构改造,如置换不稳定氨基酸或转换不稳定构象来避免蛋白水解;PEG修饰是如今最成功的策略之一,它代表了增加流体动力学体积,减少肾脏清除的亲水聚合物修饰策略,其中聚合物包括了化学聚合物、多肽聚合物以及碳水化合物聚合物;Fc融合也是一种成功的长效化策略,它代表了天然长效蛋白分子机制的利用,具有广阔发展前景;而针对免疫原性的糖基化修饰不仅可以降低蛋白免疫原性,还可以改善蛋白的理化性质.文章将对一些经典和新兴的重组蛋白长效化策略如结构修饰、聚合物修饰、蛋白修饰、糖基化进行综述,并且通过实例加以说明.