目的 探究消退素D1(RVD1)对衰老大鼠心肌细胞自噬与凋亡的调控作用以及对心肌组织线粒体-内质网偶联(MAMs)的影响.方法 将30只18月龄SD大鼠按数字随机表法分为模型组、低剂量RVD1组、高剂量RVD1组,每组10只,另取10只6月龄SD大鼠作为对照组,低剂量RVD1组和高剂量RVD1组分别尾静脉注射50、100 ng/ml RVD1,对照组和模型组同时注射等量磷酸盐缓冲液(PBS),持续干预21 d;对-硝基苯酚法测定大鼠心肌组织β-半乳糖苷酶活性,苏木精-伊红(HE)染色检测大鼠心肌组织病理形态学变化,Masson染色观察大鼠心肌组织内胶原沉积情况,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位末端标记(TUNEL)染色检测大鼠心肌细胞凋亡情况,免疫组化S-P法检测大鼠心肌组织自噬标志物微管相关蛋白3(LC3)表达,蛋白质免疫印迹(Western blot)测定大鼠心肌组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、自噬效应蛋白(Beclin-1、p62)表达水平,透射电镜观察大鼠心肌组织内MAMs结构变化,Western blot测定大鼠心肌组织中葡萄糖调节蛋白75(GRP75)、电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)及线粒体融合蛋白2(Mfn2)表达水平.结果 与模型组比较,低剂量RVD1组与高剂量RVD1组的大鼠心肌组织 β-半乳糖苷酶活性降低(P<0.05),心肌纤维断裂与心肌细胞损伤明显减轻,胶原纤维沉积明显减少,心肌组织内TUNEL阳性细胞比例减少(P<0.05),LC3蛋白阳性率增加(P<0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高、Beclin-1蛋白相对表达量上调而p62蛋白相对表达量下调(P<0.05),MAMs结构较为紧密,占线粒体周长百分比也增加(P<0.05),GRP75、VDAC1及Mfn2蛋白相对表达量均上调(P<0.05);与低剂量RVD1组比较,高剂量RVD1组大鼠心肌组织β-半乳糖苷酶活性进一步降低(P<0.05),心肌组织未见明显损伤,胶原纤维沉积进一步减少,心肌组织内TUNEL阳性细胞比例减少(P<0.05),LC3蛋白阳性率增加(P<0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高且Beclin-1蛋白相对表达量上调、p62蛋白相对表达量下调(P<0.05),MAMs结构更加紧密,其占线粒体周长百分比进一步增加(P<0.05),同时,GRP75、VDAC1及Mfn2蛋白相对表达量均进一步上调(P<0.05).结论 RVD1能够激活衰老大鼠心肌细胞自噬,减轻心肌细胞凋亡与胶原纤维沉积,并促进线粒体-内质网偶联.

目的 探讨H2O2对人皮肤成纤维细胞(NHSF)衰老标记蛋白30(SMP30)以及细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3 Ⅱ型(LC3 Ⅱ)的影响.方法 用150 μmol/L H2O2处理2～4代NHSF2h,构建细胞衰老模型作为H2O2组,而未处理的NHSF作为对照组.细胞衰老β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色法检测衰老细胞比例,间接免疫荧光检测自噬相关蛋白LC3的表达,反转录PCR(RT-PCR)检测SMP30 mRNA的表达,Western印迹法检测SMP30和LC3蛋白的表达.结果 H2O2组NHSF的SA-β-gal染色阳性率(41.70％±2.95％)显著高于对照组(3.03％±0.25％,t=22.59,P＜0.05).间接免疫荧光结果显示,H2O2组NHSF LC3阳性率(12.60％±1.57％)明显低于对照组(23.67％±3.04％,t=5.61,P＜0.05).Western印迹显示,H2O2组LC3 Ⅰ/GAPDH比值(0.40±0.02)与对照组(0.41±0.04)比较差异无统计学意义(P＞0.05),而H2O2组LC3 Ⅱ/GAPDH比值(0.20±0.02)明显低于对照组(0.80±0.03,t=29.69,P＜0.05),且H2O2组LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值(0.51±0.03)亦明显低于对照组(1.98±0.23,t=10.967,P＜0.05).H2O2组SMP30mRNA和蛋白水平(与GAPDH mRNA和蛋白的比值分别为0.16±0.01和0.27±0.02)明显低于对照组(分别为0.35±0.01和0.63±0.02),均P＜0.05.结论 H2O2可降低NHSF中SMP30及LC3 Ⅱ的表达水平,加速NHSF衰老.

目的 研究经过不同剂量紫外线中波(UVB)照射不同时间后正常人皮肤成纤维细胞(HSF)中衰老标记蛋白30 (SMP30)基因的表达改变,探讨UVB诱导HSF衰老可能的机制. 方法 以未采用UVB照射的HSF为对照组,经过不同剂量UVB(100、200、300 mJ/cm2)处理不同时间(1、2、3 d后)的HSF为实验组,四唑盐比色法(MTT)观察HSF的生长活性,流式细胞仪检测HSF的凋亡率,实时荧光定量PCR技术(FQ-PCR)检测实验组和对照组中SMP30基因的表达. 结果 不同照射时间组和不同剂量组之间,随着UVB照射时间延长和剂量的增加,HSF细胞增殖抑制率逐渐增高,细胞的凋亡率也逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.05); UVB处理后实验组中SMP30基因的相对表达水平(0.66± 0.19)明显低于对照组(1.15± 0.11),差异有统计学意义(P<0.01);SMP30基因的表达水平随着UVB作用的时间和剂量的不同而变化,呈明显的时间依赖性和浓度剂量依赖性,不同照射时间组和不同剂量组之间基因表达的差异有统计学意义(P<0.05). 结论 经过不同剂量UVB处理不同时间后可以抑制HSF细胞生长,促进细胞凋亡,大剂量长时间UVB照射可诱导HSF发生衰老改变.

目的 观察过氧化氢(H2O2)对正常人皮肤成纤维细胞(NHSF)β-链蛋白(β-catenin)和衰老标记蛋白30(SMP30)基因表达的影响,探讨H2O2可能诱导NHSF衰老的机制.方法 将传至2～4代的NHSF细胞随机分为2组:对照组和实验组.对照组NHSF细胞未作任何处理.实验组将NHSF细胞培养24 h后,分别给予50(实验1组)、100(实验2组)、150(实验3组)μmol·L-1的H2O2.在1、2、3h后,采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测各组α-catenin、SMP30基因表达的水平,并计算α-catenin mRNA、SMP30 mRNA值.结果 与对照组比较,实验组β-catenin、SMP30基因表达水平和实验1、2、3组1、2、3h时α-catenin mRNA、SMP30 mRNA水平均明显降低(均P＜0.05);与实验2组比较,实验1组1、2、3h时α-catenin mRNA、SMP30 mRNA水平均明显升高,实验3组1、2、3h时 β-catenin mRNA、SMP30 mRNA水平均明显降低(均P＜0.05).β-catenin、SMP30基因的表达对H2O2诱导有较为明显的时间依赖性和浓度剂量依赖性.结论 H2O2处理后NHSF细胞中β-catenin、SMP30基因表达水平明显降低,H2O2可能在诱导NHSF衰老中起重要作用.

目的 研究褪黑素抗心肌缺血再灌注损伤的新分子机制.方法 H9c2细胞在接受模拟缺血再灌注损伤前,用不同浓度褪黑素(Mel)(10 μmol/L、50 μmol/L、100μmol/L)预处理12 h.分别用CCK-8法检测各实验组细胞活力,酶活性测定法检测细胞中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性,DHE荧光探针检测细胞中活性氧(ROS)的含量,Fluo-4AM荧光探针检测细胞内钙离子浓度,Western blot法检测衰老标记蛋白30(SMP30)及凋亡与氧化应激相关蛋白的表达水平,免疫荧光染色检测细胞SMP30表达量.转染siRNA抑制SMP30的表达,进一步探究SMP30分子是否介导Mel的保护作用.结果Mel预处理可显著提高再灌注损伤后细胞活力,降低细胞凋亡相关蛋白的表达;降低细胞中MDA含量,增强SOD活性及抗氧化应激相关蛋白表达量,减少ROS的产生;并可显著上调SMP30的表达,降低细胞内钙离子浓度,而使用SMP30 siRNA明显逆转Mel的上述保护作用(均P＜0.05).结论 Mel通过激活SMP30分子,增强细胞抗氧化应激能力,减轻细胞钙超载,进而减少细胞凋亡和坏死,最终改善心肌细胞缺血再灌注损伤.

目的 探讨桂附地黄丸对衰老大鼠回肠干细胞增殖分化稳态的调节作用.方法 40只大鼠中10只2月龄的分为青年组、其余30只18个月龄的随机分为衰老组及桂附地黄丸低、高剂量组(0.4、1.6 g/kg),每组10只,给予生理盐水或桂附地黄丸药液灌胃4个月后,处死大鼠.HE染色、阿利新蓝染色、免疫组织化学染色、RT-PCR考察回肠组织形态学、干细胞增殖分化稳态及Wnt/β-catenin、Notch信号通路相关蛋白表达.结果 与衰老组比较,桂附地黄丸组回肠绒毛缩短,隐窝变浅,绒毛长度与隐窝深度比值(V/C)增大,杯状细胞数量、细胞核增殖抗原(PCNA)表达、干细胞标记物mRNA表达下降,Wnt/3-catenin信号通路相关蛋白表达下调,但Noah信号通路相关蛋白表达无明显变化.结论 桂附地黄丸可改善衰老大鼠回肠干细胞增殖分化稳态,其机制可能与下调Wnt/β-catenin信号通路有关.

目的 探讨人肝癌相关抗原衰老标记蛋白30(SMP30)对人外周血树突状细胞(DC)成熟的影响.方法用Ficoll密度梯度离心法从健康成人外周血中分离获得外周血单个核细胞,用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4诱导生成DC,用流式细胞术对DC进行鉴定.将DC随机分为SMP30慢病毒组、空载慢病毒组,分别用人肝癌相关抗原SMP30重组慢病毒和空载慢病毒进行体外转染,另设空白对照组.荧光显微镜下观察各组绿色荧光蛋白表达情况,以判断DC的转染效率;Western blotting法检测各组SMP30蛋白表达;ELISA法检测各组白细胞介素12(IL-12)、干扰素γ(INF-γ)分泌情况;流式细胞术检测各组表面共刺激分子CD80和CD86表达.结果 荧光显微镜下观察到SMP30慢病毒组和空载慢病毒组成功表达绿色荧光蛋白,而空白对照组DC无绿色荧光蛋白表达.与空载慢病毒组、空白对照组比较,SMP30慢病毒组SMP30表达高,IL-12、INF-γ分泌量高,CD80、CD86表达率高(P均＜0.05).结论 体外转染人肝癌相关抗原SMP30慢病毒可促进人外周血DC的成熟.

目的 初步探讨衰老标记蛋白30 (senescence marker protein 30,SMP30)的增加对处于急性氧化应激初期的人晶状体上皮细胞株SRA01/04的保护作用.方法 将处于对数生长期的SRA01/04接种于96孔板,分别使用含150μmol·L-1、200 μmol·L-1、250 μmol·L-1、300 μmol·L-1、350 μmol·L-、400 μmol·L-1、450μmol·L-1H2O2的培养基作用2h,CCK-8法选取最佳H2O2浓度;使用慢病毒对SRA01/04进行转染建立SMP30高表达模型,实验分3组:SMP30过表达(over expression,OE)组、SMP30过表达相应空载(negative control over expression,NCOE)组及对照(control,CON)组.通过超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)定量检测试剂盒、氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)/总谷胱甘肽(total glutathione,T-GSH)测定试剂盒测量细胞内SOD活力及GSSG/T-GSH比值的变化.结果 经分析,建立模型的最佳H2O2浓度为300 μmol·L-1.在此浓度下,与CON组(5.783±0.192)U·mg-1及NCOE组(5.837±0.182)U·mg-1相比,OE组细胞内SOD活力升高,为(10.251±0.110)U·mg-;与CON组(29.943±0.241)及NCOE组(30.037±0.433)相比,OE组细胞内GSSG/T-GSH比值(20.990±0.342)降低;差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 当SRA01/04处于H2O2诱导的急性氧化应激初期时,SMP30表达的增加可通过增加SOD活力和降低GSSG/T-GSH比值,加强SRA01/04的抗氧化能力.

[目的]探讨在高钙诱导细胞氧化应激下,高表达衰老标记蛋白30(SMP30)对人晶状体上皮细胞(HLEC)株SRA01/04增殖活力及抗氧化能力的影响.[方法]实验分3组:SMP30高表达组(OE,实验组)、NCOE组(阴性对照组)及SRA01/04组(空白对照组).用OE及NCOE慢病毒载体分别转染SRA01/04细胞.15mmol/LCaCl2处理细胞24 h建立高钙诱导模型.BrdU法检测细胞增殖、超氧化物歧化酶(SOD)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)/总谷胱甘肽(T-GSH)法检测细胞氧化指标.[结果]荧光显微镜下可见各组转染细胞有大量绿色荧光蛋白(GFP)表达,转染效率接近80％,提示SMP30高表达SRA01/04细胞模型构建成功.在高钙状态下,OE组细胞相对增殖活力(3.89±0.20)和SOD活力(U/mg,47.5±4.3)均高于NCOE组(2.82±0.34、30.6±4.2)及SRA01/04组(2.96±0.25、26.8±1.5),OE组GSSG/T-GSH比值(2.36±0.51)低于NCOE组(16.36±2.48)及SRA01/04组(20.12±2.54),上述差异均有统计学意义(n=3,P＜0.05),NCOE组与SRA01/04组相比差异均无统计学意义(n=3,P＞0.05).[结论]高表达SMP30增加SRA01/04 (HLEC)细胞增殖活力、SOD活力及下降GSSG/T-GSH水平,提示SMP30在一定程度上可缓解高钙诱导细胞氧化损伤的进程,可能对HLEC有保护作用.

目的:探讨在急性氧化应激状态下人晶状体上皮细胞株SRA01/04内衰老标记蛋白30 (SMP30)、Caspase-3、Ca2+-ATP表达的变化.方法:通过慢病毒转染建立SMP30过表达(OE)组、过表达空载对照(NC-OE)组、SMP30沉默(KD)组及沉默空载(NC-KD)组SRA01/04细胞,RT-PCR和Western blotting检测SMP30含量鉴定细胞是否转染成功;用300μmol/L H2 O2作用2h,构建急性氧化应激状态时,PCR检测各组细胞SMP30基因的表达情况,Western blotting检测各组细胞SMP30、Caspase-30和Ca2+-ATP蛋白的表达量.结果:在正常状态时,OE组SMP30基因及其蛋白表达量高于NC-OE组(P＜0.05),KD组的SMP30基因及其蛋白表达量低于NC-KD组(P＜0.05).OE组及KD组细胞SMP30基因表达量均出现增加(P＜0.05),与正常状态时相比,急性氧化应激状态时OE组细胞SMP30蛋白表达上调(P＜0.05);正常状态时,OE组Caspase-3蛋白表达量低于NC-OE组,KD组Caspase-3蛋白表达量高于NC-KD组(P＜0.05).急性氧化应激状态时,OE组Caspase-3蛋白表达量低于NC-OE组,KD组Caspase-3蛋白表达量低于NC-KD组(P＜0.05).在急性氧化应激状态时OE组Caspase-3蛋白表达量低于正常状态时;KD组的Caspase-3蛋白表达量高于正常状态时KD组(P＜o.05).在正常状态时,OE组Ca2+-ATP蛋白表达量高于NC-OE组,KD组Ca2+-ATP蛋白表达量低于NC-KD组(P＜0.05).在急性氧化应激状态时,OE组Ca2+-ATP蛋白表达量高于NC-OE组,KD组Ca2+-ATP蛋白表达量低于NC-KD组(P＜0.05).在急性氧化应激状态时OE组的Ca2+-ATP蛋白表达量高于正常状态时(P＜0.05).结论:在急性氧化应激状态时,SMP30含量出现反应性增加,过表达SMP30可能对人晶状体上皮细胞株SRA01/04具有抗氧化、抗凋亡、增加钙调节活性的作用.