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非靶向串联质谱分析人早期胚胎级别与其培养液中相关氨基酸和肉碱水平的关联
编辑人员丨1周前
目的:检测体外培养不同级别早期人胚胎的培养液中氨基酸和肉碱水平,探讨基于质谱的微量分析技术用于评价胚胎体外发育潜能的可行性。方法:从2022年6至12月在临沂市人民医院生殖医学科接受体外受精-胚胎移植治疗的不孕夫妇中,收集女方年龄31.5(26.5,33.25)岁,且获卵数在8~20个的不孕夫妇,从中随机挑选30对不孕夫妇收取其第3天细胞胚的培养液共126份,依据其所对应的胚胎的形态级别分为优( n=43)、中( n=49)和差3( n=34)组。通过液相色谱-质谱联用检测不同培养液中氨基酸和肉碱水平。通过方差分析比较不同组间氨基酸与肉碱水平的差异,通过Pearson相关分析氨基酸与肉碱水平的关联,偏最小二乘法分析氨基酸和肉碱水平与胚胎评估级别的关联。 结果:甲硫氨酸/苯丙氨酸(比值)在优胚、中胚和差胚3组间分别为3.09±1.67、4.00±1.19和4.99±2.04,差异有统计学意义( F=7.09, P<0.05),优胚与中胚间( t=-0.91, P<0.05)、优胚与差胚间( t=-1.91, P<0.05)及中胚与差胚间( t=-0.99, P<0.05)差异均有统计学意义。不同氨基酸之间,苯丙氨酸与酪氨酸的正相关性最强( r=0.99, P<0.01);不同肉碱之间,辛酰肉碱与葵酰肉碱比值(C 8/C 10)与(戊二酰肉碱+3-羟基己酰肉碱)/棕榈酰肉碱比值[(C 5DC+C 6OH)/C 16]的正相关性最强( r=0.44, P<0.001);偏最小二乘法拟合模型计算氨基酸/肉碱水平与胚胎级别相关的权重:亮氨酸(异亮氨酸)为2.22,精氨酸为1.99,缬氨酸/苯丙氨酸为1.65,甘氨酸为1.54,酪氨酸为1.21,(戊二酰肉碱+3-羟基己酰肉碱)/辛酰肉碱(C 5DC+C 6OH)/C 8为1.15。 结论:胚胎培养液中亮氨酸、精氨酸、缬氨酸/苯丙氨酸比值、甘氨酸、酪氨酸以及肉碱比值(C 5DC+C 6OH)/C 8与体外培养人早期胚胎级别显著相关。
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编辑人员丨1周前
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克尔斯滕大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物突变亚型对非小细胞肺癌细胞程序性细胞死亡配体1和2的表达影响
编辑人员丨1周前
目的:探讨克尔斯滕大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)突变亚型对非小细胞肺癌细胞程序性细胞死亡配体1(PD-L1)和2(PD-L2)的表达影响。方法:纳入2018年1月至2021年1月甘肃省肿瘤医院收治的KRAS阳性非小细胞肺癌患者95例,通过测序检测KRAS基因组序列,通过实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和免疫印迹检测PD-L1和PD-L2的表达。使用成簇的规则间隔的短回文重复基因编辑(CRISPR/CAS9)技术构建KRAS缺失型A549细胞,在敲除株中过表达KRAS野生型和突变型,检测其对PD-L1和PD-L2的表达影响。将KRAS野生型和突变型过表达的KRAS敲除人肺泡上皮细胞549(A549)细胞株与树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK),通过流式细胞术检测群集行列式蛋白3阳性(CD3 +)细胞的凋亡水平。使用 t检验比较连续变量。使用Mann-Whitney检验分析KRAS突变型患者PD-L1和PD-L2。Chi-square检验分析非小细胞肺癌患者KRAS突变型和KRAS野生型的临床特征。 结果:纳入KRAS阳性非小细胞肺癌患者95例,KRAS野生型31例、KRAS突变型64例;其中KRAS第12位甘氨酸突变为天冬氨酸(G12D)13例、突变为缬氨酸(G12V)12例、突变为半胱氨酸(G12C)25例、突变为丙氨酸(G12A)14例。KRAS突变型患者PD-L1和PD-L2的mRNA表达水平(1.062比1.834, U=38;1.062比1.668, U=70;1.062比1.544, U=111;1.062比1.479, U=89, P<0.05;1.067比1.798, U=68;1.067比1.595, U=86;1.067比1.527, U=171;1.067比1.680, U=34, P<0.05)和蛋白表达水平均高于KRAS野生型患者,差异有统计学意义。在KRAS敲除A549细胞株中,相较于KRAS野生型,KRAS突变型更能够促进PD-1配体PD-L1和PD-L2的表达同时,将KRAS-G12D,KRAS-G12V,KRAS-G12C,KRAS-G12A质粒混合在一起作为RAS野生型(KRAS-MT)与KRAS突变型(KRAS-WT)分别转染KRAS敲除A549细胞株,KRAS-MT依旧可以促进PD-1配体PD-L1和PD-L2的表达。在KRAS敲除A549细胞株中过表达KRAS-MT与KRAS-WT后,KRAS突变亚型不能激活细胞外信号调节激酶(ERK)通路,但是可以激活丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT)通路。AKT抑制剂处理后,KRAS-MT与KRAS-WT转染KRAS敲除A549细胞株的PD-L1和PD-L2的表达差异无统计学意义。将转染了KRAS-MT或KRAS-WT的KRAS KO A549细胞株与DC-CIK以1∶1的比例共培养,随后检测DC-CIK细胞的凋亡水平,发现KRAS-MT能够显著增加DC-CIK细胞中CD3 +细胞亚群的凋亡( F=12.5, P<0.05),差异有统计学意义。 结论:KRAS突变亚型能够显著增强非小细胞肺癌细胞PD-1配体PD-L1和PD-L2的表达,并且能够促进免疫细胞DC-CIK细胞中CD3 +细胞亚群的凋亡。
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编辑人员丨1周前
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2016年浙江省温岭地区EV71型轻、重症手足口病患儿病毒分离株VP1和VP4区基因特征分析
编辑人员丨1周前
目的:分析并比较2016年浙江省温岭地区EV71型轻、重症手足口病(HFMD)患儿病毒分离株VP1和VP4区基因特征及进化关系。方法:研究对象为2016年浙江省温岭市第一人民医院分离鉴定的EV71型HFMD患儿,随机选取轻、重症HFMD患儿EV71病毒株各6例,进行VP1和VP4区基因扩增和测序,利用DNAStar和Mega 6.0软件对测序结果与美国国立生物信息中心公布的EV71典型基因代表株(A、B1~5、C1~4亚型)进行核苷酸和氨基酸比对分析,并构建系统进化树。结果:轻、重症手足口病患儿性别(χ 2=14.51, P<0.05)和年龄( t=2.82, P<0.05)差异无统计学意义。两组EV71分离株的VP1区核苷酸同源性为95.8%~99.6%,氨基酸同源性为99.1%~100%;VP4区核苷酸同源性为95.0%~99.9%,氨基酸同源性为99.0%~100%,轻、重症EV71分离株同源性高。它们与典型C4a基因型代表株最接近,氨基酸同源性为:96.6%~100%(VP1)和94.3%~100%(VP4)。3例EV71型重症HFMD患儿分离株分别出现VP1区V170L突变(缬氨酸→亮氨酸),VP1区A293S(丙氨酸→丝氨酸)以及VP4区T7A(苏氨酸→丙氨酸),其他未见明显突变。 结论:2016年浙江温岭地区轻、重症HFMD患儿EV71病毒分离株VP1和VP4区同源性高,且均属于C4a基因亚型。其中几个位点的氨基酸突变可能与浙江温岭地区HFMD患儿疾病危重有关。
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编辑人员丨1周前
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PD-L1靶向单域抗体的定点标记及生物学评价
编辑人员丨1周前
目的:设计合成 68Ga-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)-半胱氨酸-天冬氨酸-缬氨酸(CDV)-Nb109,探讨其用于检测不同肿瘤中程序性细胞死亡蛋白配体1(PD-L1)表达水平的潜力。 方法:采用基因工程技术将CDV引入单域抗体Nb109序列的尾部,通过马来酰亚胺-半胱氨酸定点偶联策略,将马来酰亚胺-DOTA与CDV-Nb109(物质的量比1∶1)反应制备前体DOTA-CDV-Nb109,随后进行 68Ga标记并用PD-10脱盐柱纯化。建立人黑色素瘤A375、人源性PD-L1转染的A375-hPD-L1及人胶质瘤U87荷瘤裸鼠模型,通过稳定性分析、细胞摄取和microPET显像评价 68Ga-DOTA-CDV-Nb109的诊断价值。采用单因素方差分析和最小显著差异 t检验分析数据。 结果:68Ga-DOTA-CDV-Nb109放射化学产率为(69.79±4.69)%,放化纯大于97%,摩尔活度为(12.85±1.51) GBq/μmol。 68Ga-DOTA-CDV-Nb109与A375-hPD-L1细胞具有较强的亲和力,解离常数( Kd)为(66.43±17.89) nmol/L。 68Ga-DOTA-CDV-Nb109在A375-hPD-L1细胞[(3.17±0.15)百分加入放射性剂量(%AD)]、U87细胞[(2.08±0.03) %AD]中的摄取明显高于A375细胞[(1.21±0.14) %AD; F=82.87, t值:15.23、9.98, P值:<0.001、0.003]。 68Ga-DOTA-CDV-Nb109在A375-hPD-L1[(5.21±0.35)每毫升百分注射剂量率(%ID/ml)]和U87[(3.44±0.69) %ID/ml]荷瘤裸鼠肿瘤中的摄取显著高于A375荷瘤裸鼠[(2.17±0.36) %ID/ml; F=249.72, t值:35.70、3.43,均 P<0.001]。 结论:成功制得定点标记的PET探针 68Ga-DOTA-CDV-Nb109,可无创、动态监测不同肿瘤中PD-L1表达水平的变化,在PD-L1免疫检查点阻断治疗潜在受益患者筛选方面具有应用潜力。
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编辑人员丨1周前
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四川地区早产儿干血斑中氨基酸切值的探讨
编辑人员丨1周前
目的:探讨四川地区早产儿干血斑中氨基酸含量的切值。方法:回顾性分析2018年1月至2019年12月在四川地区采用串联质谱技术进行遗传代谢病(IMD)筛查的新生儿临床数据。根据胎龄分为2组:早产儿组2 264例(男1 312例,女952例),足月儿组53 275例(男28 269例,女25 006例) ,干血斑中氨基酸切值采用百分位数法( P0.5~ P99.5)表示,组间比较采用秩和检验。 结果:1.早产儿干血片内11种氨基酸[丙氨酸(ALA)、精氨酸(ARG)、瓜氨酸(CIT)、甘氨酸(GLY)、亮氨酸(LEU)、蛋氨酸(MET)、鸟氨酸(ORN)、苯丙氨酸(PHE)、脯氨酸(PRO)、酪氨酸(TYR)、缬氨酸(VAL)]均呈非正态分布。2.早产儿IMD检测指标参考区间:ALA为114.76~545.48 μmol/L、ARG为1.34~47.04 μmol/L、CIT为5.66~32.02 μmol/L、GLY为181.48~909.93 μmol/L、LEU为71.10~283.29 μmol/L、MET为4.21~34.51 μmol/L、ORN为40.58~293.76 μmol/L、PHE为23.60~106.30 μmol/L、PRO为77.76~358.24 μmol/L、TYR为27.52~352.91 μmol/L、VAL为53.74~228.37 μmol/L。3.足月儿IMD检测指标参考区间:ALA为135.20~552.33 μmol/L、ARG为1.30~42.73 μmol/L、CIT为5.92~30.35 μmol/L、GLY为208.17~980.09 μmol/L、LEU为72.91~287.49 μmol/L、MET为4.27~33.90 μmol/L、ORN为48.40~305.59 μmol/L、PHE为27.63~92.27 μmol/L、PRO为97.38~372.75 μmol/L、TYR为40.19~276.54 μmol/L、VAL为65.75~237.92 μmol/L。4.除PHE( Z=-0.58, P>0.05)早产儿与足月儿差异无统计学意义外,2组间ALA( Z=-15.32, P<0.05)、ARG( Z=-5.62, P<0.05)、CIT( Z=-5.86, P<0.05)、GLY( Z=-14.52, P<0.05)、LEU( Z=-5.62, P<0.05)、MET( Z=-5.22, P<0.05)、ORN( Z=-13.01, P<0.05)、PRO( Z=-22.09, P<0.05)、TRY( Z=-2.09, P<0.05)、VAL( Z=-17.82, P<0.05)等指标差异均有统计学意义。 结论:四川地区早产儿氨基酸参考区间的建立可为IMD实验室筛查提供参考依据,减少误判风险,使疾病诊断趋于精准。
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编辑人员丨1周前
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酒精性肝硬化患者血清支链氨基酸水平及与疾病严重程度相关性研究
编辑人员丨1周前
目的:探讨酒精性肝硬化(alcoholic liver cirrhosis,ALC)患者血清支链氨基酸及芳香族氨基酸的特点,为临床上制定营养干预方案提供理论依据。方法:以2017年8月至2019年8月期间首都医科大学附属北京佑安医院诊治的40例ALC患者为研究组,以20例乙型肝炎所致肝硬化患者(HBV-LC)和10例健康体检者(HC)为对照组。采用超快速液相色谱串联四级杆质谱法(LC-MS/MS)完成血清异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸浓度测定,并计算Fischer比值。结果:研究组支链氨基酸中的异亮氨酸浓度为(23.74±8.81)μmol/L,明显低于HBV-LC组的(30.85±8.70)μmol/L及HC组的(61.51±23.06)μmol/L,比较差异有统计学意义( P=0.031, P<0.01)。ALC组亮氨酸浓度为(127.99±38.54)μmol/L,明显低于HC组的(153.70±11.88)μmol/L,比较差异有统计学意义( P=0.036),与HBV-LC组比较差异无统计学意义( P=0.890)。ALC组缬氨酸浓度为(39.56±10.51)μmol/L,明显低于HBV-LC组的(124.71±45.00)μmol/L和HC组的(164.23±37.16)μmol/L,比较差异有统计学意义(均为 P<0.01)。ALC组苯丙氨酸浓度为(141.19±29.35)μmol/L,明显高于HBV-LC组的(116.07±21.52)μmol/L和HC组的(80.94±7.16)μmol/L,比较差异有统计学意义( P=0.001, P<0.01)。ALC组的Fischer比值为(1.17±0.34),明显低于HBV-LC组的(2.07±0.66)和HC组的(3.36±0.50),比较差异有统计学意义( P均 <0.01)。ALC组的异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸浓度从Child-Pugh A级到C级逐渐降低。ALC组Child-Pugh C级、Child-Pugh B级Fischer比值分别为1.01±0.22、1.15±0.32,明显低于Child-Pugh A级1.52±0.38( P=0.001、 P=0.008)。 结论:与HBV-LC患者相比,ALC患者异亮氨酸、缬氨酸及Fischer比值明显下降,Child-Pugh B级及C级更加明显,A级患者中Fischer比值下降早于血清白蛋白的水平降低。营养干预需要关注其支链氨基酸的变化。
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编辑人员丨1周前
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粪菌移植对非肥胖糖尿病小鼠发生1型糖尿病的影响及其机制探讨
编辑人员丨1周前
目的:探讨粪菌移植(FMT)对非肥胖糖尿病(NOD)小鼠发生1型糖尿病(T1DM)的影响及相关机制。方法:8~9周龄的雌性NOD小鼠72只,随机数字表法分为对照组( n=36)和FMT组( n=36)。FMT组移植C57BL/6鼠的粪菌,对照组移植自身粪菌,隔日1次,共5次。比较两组小鼠的胰岛炎评分和T1DM发病率;通过16S rRNA基因测序评估NOD小鼠粪菌组成;实时定量PCR检测肠屏障相关基因的表达水平;流式细胞术检测肠-胰腺免疫轴中调节性T细胞(Treg)、辅助性T细胞(Th)-1及Th17的比例;通过氨基酸代谢组学检测血清中氨基酸的水平。 结果:26周龄时FMT组的T1DM发病率为40.9%(9/22),低于对照组的72.7%(13/22)( P=0.034)。FMT促进了肠道中有益菌,如 Lactobacillus、 Clostridium_sp_ND2、 Candidatus_Arthromitus和 Clostridiaceae_1的定植。与对照组相比,FMT组肠屏障相关基因的mRNA表达上调[黏蛋白(Muc)-1:0.93±0.29比2.97±0.79, P=0.036;Muc2:0.72±0.39比10.70±3.54, P=0.019;Muc3:1.79±0.69比10.97±2.78, P=0.009;Muc4:1.01±0.23比2.42±0.49, P=0.029;封闭蛋白(Ocln):0.96±0.08比1.81±0.36, P=0.045;闭合蛋白(Cldn)-1∶0.94±0.17比2.20±0.43, P=0.022]。与对照组相比,FMT组肠系膜淋巴结、胰腺淋巴结、派伊尔结中Treg比例增加[(6.10±0.49)%比(7.54±0.27)%, P=0.020;(5.28±0.39)%比(6.42±0.34)%, P=0.048;(6.78±0.42)%比(7.88±0.13)%, P=0.029];Th1比例减少[(1.02±0.06)%比(0.83±0.06)%, P=0.040;(0.82±0.10)%比(0.56±0.05)%, P=0.038;(1.28±0.12)比(0.85±0.07), P=0.012],Th17比例减少[(0.40±0.01)%比(0.30±0.02)%, P=0.004;(0.40±0.02)%比(0.31±0.02)%, P=0.008;(0.51±0.06)比(0.36±0.02), P=0.027)]。与对照组相比,FMT组小鼠血清中亮氨酸[(92.86±7.32)比(91.87±12.62)μmol/L, P=0.027)]、缬氨酸[(162.74±15.97)比(155.89±25.70)μmol/L, P=0.046)]、异亮氨酸[(75.65±5.59)比(73.61±9.67)μmol/L, P=0.048)]含量减少。 结论:FMT可减轻NOD小鼠的胰岛炎并减缓T1DM的发生,其机制可能与重塑NOD小鼠肠道菌群并改善肠屏障功能、影响肠-胰腺免疫轴的免疫反应、同时纠正胰岛炎期NOD小鼠的氨基酸代谢紊乱、减少支链氨基酸的蓄积有关。
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编辑人员丨1周前
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初诊多发性骨髓瘤的代谢轮廓及其代谢通路
编辑人员丨1周前
目的:探讨初诊多发性骨髓瘤(MM)的代谢物轮廓和代谢通路。方法:收集2016—2017年苏州大学附属第一医院初次确诊MM患者(55例)的血清,收集年龄性别匹配的健康人群(37例)的血清作为对照。采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术对初治MM患者与健康人群血清进行高通量检测及鉴定,通过计算质量控制(QC)样本的相对标准偏差值(RSD)对样品制备的重现性进行考察。运用偏最小二乘判别分析方法结合 t检验校正的方法筛选MM患者及健康人群的差异性代谢物,使用代谢通路分析工具构建代谢通路。 结果:55例MM患者中,男34例,女21例,中位年龄60岁(42~73岁)。根据M蛋白类型进行分型,IgG型30例,IgA型9例,IgM型1例,未分泌型2例,双克隆型1例,轻链型12例(kappa轻链型3例,lambda轻链型9例)。通过对GC-MS实验数据重现性考察,QC样本检测显示代谢物相对含量的RSD<15%的化合物比例为70.21%,提示实验数据可靠。MM患者区别于健康对照人群的17种差异性代谢物为肉豆蔻酸、羟脯氨酸、半胱氨酸、软脂酸、L-亮氨酸、硬脂酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、甘油、丝氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、柠檬酸、肌醇、苏氨酸、草酸(VIP>1, P<0.05)。MM患者的代谢紊乱主要涉及苯丙氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、磷酸肌醇代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、甘油脂代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢。 结论:与健康对照人群比较,初诊MM患者存在明显的代谢轮廓差异和代谢通路扰动。
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编辑人员丨1周前
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地卷柏中肽类化学成分及其神经保护活性研究
编辑人员丨3周前
摘 要:研究地卷柏Selaginella prostrata全草中的肽类化学成分及其神经保护活性.基于茚三酮试剂显色的薄层原位化学反应导向分离方法,综合运用正、反相硅胶柱色谱和半制备液相色谱等多种分离技术进行分离纯化,通过波谱数据分析和文献比对鉴定化合物的结构.共从地卷柏全草的95%乙醇提取物中分离得到15个肽类化合物,分别鉴定为 pulvpeptin A(1)、nocardiotide A(2)、dianthin C(3)、longicalycinin A(4)、橙黄胡椒酰胺(5)、橙黄胡椒酰胺乙酸酯(6)、环-(L-酪氨酸-L-脯氨酸)(7)、环-(L-羟脯氨酸-L-亮氨酸)(8)、环-(L-亮氨酸-L-异亮氨酸)(9)、环-(L-脯氨酸-L-苯丙氨酸)(10)、环-(L-缬氨酸-L-脯氨酸)(11)、环-(L-脯氨酸-L-亮氨酸)(12)、环-(L-脯氨酸-L-异亮氨酸)(13)、环-(L-缬氨酸-L-苯丙氨酸)(14)、环-(L-缬氨酸-L-缬氨酸)(15).所有化合物均为首次从地卷柏中分离获得,化合物2~4、7~15为首次从卷柏属植物中分离获得.通过建立H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤模型,采用MTT法评价分离所得化合物的神经保护活性.结果显示在50 μmol/L浓度下,化合物5、6和8显示出较好的神经保护活性.本研究为地卷柏的开发利用研究提供了理论基础.
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编辑人员丨3周前
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盐酸缬更昔洛韦的合成工艺改进
编辑人员丨3周前
目的 盐酸缬更昔洛韦的合成工艺改进.方法 以更昔洛韦为原料,经乙酰基保护单羟基制得O-单乙酰更昔洛韦,与Cbz-L-缬氨酸经缩合,再经盐酸脱乙酰基得更昔洛韦-Cbz-L-单缬氨酸酯,酸化后在连续流反应器中催化氢化脱苄氧羰基得盐酸缬更昔洛韦粗品,粗品在异丙醇/水(2∶1,V/V)中重结晶得到盐酸缬更昔洛韦.结果 工艺改进后的操作更加简便安全,可以实现长时间稳定和安全的连续流生产及后处理,目标产品1的收率和纯度得到提高,总收率48.8%,纯度99.4%.结论 为盐酸缬更昔洛韦的合成提供了一种较新的方法,生产成本得以降低.
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编辑人员丨3周前
