[背景]口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的感染牛、羊和猪等偶蹄动物的主要疫病之一.口蹄疫病毒的结构蛋白VP1 包含多个能够引起机体免疫反应的主要位点,因此 VP1 是研究亚单位疫苗的方向靶标.谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)作为安全生产菌株,是医药用蛋白生产的优势细胞工厂.[目的]利用C.glutamicum作为受体菌株表达外源蛋白的优势实现VP1 的外源表达.[方法]根据VP1 结构蛋白的基因序列、相应功能和C.glutamicum的密码子偏好性设计并合成VP1 基因,与pXMJ19载体连接构成重组质粒pXMJ19-VP1.C.glutamicum CGMCC 1.15647 菌株用于表达VP1-6×his蛋白,并对蛋白表达元件启动子、5′非翻译端(5′UTR)、目的蛋白自身N端等进行优化,同时对培养条件等进一步优化,采用SDS-PAGE和Western blotting技术检测VP1 蛋白的表达情况.最后应用间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定本研究中生产的VP1 的免疫活性.[结果]SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明VP1 蛋白能在C.glutamicum CGMCC 1.15647 菌株成功表达,将Ptac启动子替换为合成型启动子PH36 能提高蛋白产量.在此基础上,通过插入不同的 5′UTR序列和VP1 蛋白N端氨基酸的改变能进一步提高蛋白产量并可利用CspB信号肽实现分泌表达.发酵试验表明,VP1 摇瓶发酵培养最优条件为 30℃、24 h.ELISA试验表明,本研究中的 VP1 可与阳性血清特异性结合.[结论]本研究在谷氨酸棒状杆菌中成功表达 FMDV的VP1蛋白,并通过优化蛋白表达元件的方法进一步提高了产量,为开发新型FMD免疫诊断试剂和安全高效的亚单位疫苗奠定了良好的基础.

谷氨酸棒状杆菌是目前微生物发酵生产L-缬氨酸的主要工业菌株.文中首先在谷氨酸棒状杆菌VWB-1中敲除了alaT(丙氨酸氨基转移酶),获得突变菌株VWB-2,作为出发菌株.进而对L-缬氨酸合成途径关键酶——乙酰羟酸合酶(ilvBN)的调节亚基进行定点突变(ilvBN1M13),解除L-缬氨酸对该酶的反馈抑制.然后辅助过量表达L-缬氨酸合成途径关键基因ilvBN1M13、乙酰羟酸异构酶(ilvC)、二羟酸脱水酶(ilvD)、支链氨基酸氨基转移酶(ilvE),加强通往L-缬氨酸的碳代谢流,提高菌株的L-缬氨酸水平.最后,基于过量表达L-缬氨酸转运蛋白编码基因brnFE及其调控蛋白编码基因lrp1,提高细胞的L-缬氨酸转运能力.最终获得工程菌株VWB-2/pEC-XK99E-ilvBN1M13CE-lrp1-brnFE在5L发酵罐中的L-缬氨酸产量达到461.4 mmol/L,糖酸转化率达到0.312 g/g葡萄糖.

[背景]谷氨酸棒状杆菌的基因敲除系统较为匮乏且效率不高,难以对其进行代谢工程改造,不利于高性能工业菌株的构建及规模生产.[目的]分别采用CRISPR-Cpf1和Cre/loxP基因敲除系统对谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 (Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)基因组上的argR和argF基因进行敲除,比较两种敲除方法的优缺点,为合理选择敲除系统提供依据.[方法]特异性重组的Cre/loxP敲除系统是首先利用同源重组将基因组上的靶基因替换为两端带有重组位点loxP的kanR片段,然后由重组酶Cre识别loxP位点并发生重组反应,从而去除替换到基因组上的kanR片段,进一步利用质粒的温敏特性将其消除,从而实现靶基因的敲除.CRISPR-Cpf1敲除系统是利用Cpf1对pre-crRNA进行加工,形成的成熟crRNA引导Cpf1识别和结合到靶DNA的特定序列上并切割双链DNA分子,通过同源重组作用去除靶基因,基于质粒自身的温敏特性将其消除,从而完成基因敲除的整个过程.[结果]Cre/loxP系统可在8N+2d内完成N轮迭代基因敲除,而CRISPR-Cpf1系统可在5N+2 d内完成N轮迭代基因无痕敲除,理论上还可以一次对多个靶位点进行编辑,效率更高,但存在同源重组效率较低、假阳性率高等缺点.[结论]与Cre/loxP系统相比,CRISPR-Cpf1辅助的同源重组基因敲除方法可省时、省力地实现基因的无痕敲除,理论上还可实现多个基因的同时敲除、总体效率更高,然而编辑效率还有提高的空间.

lysC、asdA基因分别编码的天冬氨酸激酶(Aspartate kinase,AK)和天冬氨酸半醛脱氢酶(Aspartate semi-aldehyde dehydrogenase,ASD)是L-苏氨酸合成途径中两个关键限速酶基因,其中AK受到代谢产物赖氨酸与苏氨酸的协同抑制.以选育获得的一株谷氨酸棒状杆菌T11(Corynebacterium glutamicum T11)为出发菌株,通过构建lysC-asdA串联表达盒,并对其关键限速酶基因lysC进行定点突变,突变位点为Ala279Thr,获得抗反馈抑制突变型编码基因lysCr-asdA,将其插入含强启动子tac的穿梭表达载体pZ8-1中成功构建串联表达质粒pZ8-1-lysCr-asdA转化出发菌株,筛选获得工程菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA.摇瓶发酵其L-苏氨酸产量达到7.18 g/L,较出发菌株提高27.8％.进一步的30 L发酵罐补料分批发酵结果显示,发酵60 h L-苏氨酸产量达65.5 g/L,糖酸转化率达到39.5％,较出发菌株分别提高29.5％ 和33.9％,为后续的进一步构建高产L-苏氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株提供强有力的基础.

萜类化合物具有可观的商业价值,但生产过程复杂,产量低,利用微生物异源合成萜类化合物已成为热点.谷氨酸棒状杆菌内含合成萜类色素的途径,具有异源合成萜类化合物的天然优势和研究前景.首次对谷氨酸棒状杆菌合成萜类化合物进行了综述,从萜类合成途径、关键酶和全局调控机制三个方面进行了途经介绍.概述了谷氨酸棒状杆菌中单萜、倍半萜、四萜类化合物的异源合成,并对利用谷氨酸棒状杆菌高效合成萜类化合物所需解决的问题进行讨论,为谷氨酸棒状杆菌高效合成萜类化合物提供建议.

目的 评估以金色分枝杆菌作为结核分枝杆菌模式菌株筛选抗结核抑制剂的可行性.方法 以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv建立细胞水平的抑制剂高通量筛选模型,对本单位化合物库部分样品进行筛选,获得具有抗结核活性的化合物;进一步比较模式菌株金色分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、海分枝杆菌及谷氨酸棒状杆菌对具有较强抗结核活性样品的敏感性差异.结果 利用基于结核分枝杆菌建立的全细胞筛选模型,从本单位化合物库的5万个样品中筛选得到67个最低抑菌浓度≤5μg/ml的化合物.对金色分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、海分枝杆菌和谷氨酸棒状杆菌有抑制活性的样品分别有22个(32.84％)、10个(14.93％)、12个(17.91％)和6个(8.96％),其中抑菌活性与抗结核活性差异在4倍以内的样品分别有16个(72.73％)、5个(50％)、7个(58.33％)和3个(50％).结论 相对于其他3种模式菌株,金色分枝杆菌对本单位样品库化合物的敏感性与结核分枝杆菌的最为接近,以金色分枝杆菌为模式菌株开展抑制剂筛选研究更有可能获得具有抗结核活性的化合物.

为了建立定量检测人血清中Ⅰ型前胶原氨基端肽(Type Ⅰ procollagen N-terminal peptide,PINP)的化学发光免疫分析检测方法,首先在谷氨酸棒状杆菌中分泌表达了PINP-α1链重组蛋白,以其为免疫原制备单抗,获得了2B10、8C12和1F11共3株可稳定分泌抗PINP-α1链的单抗杂交瘤细胞株.进一步配对筛选后,以单抗8C12偶联生物素作为捕获抗体,单抗1F11标记辣根过氧化物酶作为检测抗体,二者与样本中的PINP结合形成夹心复合物,再与包被有链霉亲和素的磁微粒形成完整的检测系统,从而定量检测人血清中PINP的浓度.对该方法进行条件优化后,确定捕获抗体、检测抗体的最佳工作浓度均为3 μg/mL,孵育时间为30 min;本方法的最低检测限为1.22 ng/mL,批内、批间的变异系数均在10％以内,线性范围为5-1100 ng/mL,回收率在93％-107％之间.通过对160份临床样本进行检测,本方法检测结果与罗氏诊断试剂盒检测结果的相关系数R2为0.9062.开发的磁微粒化学发光免疫分析检测方法可定量检测人血清中PINP的含量,有望成为骨骼疾病检查的辅助手段.

透明质酸(hyaluronic acid,HA)是广泛存在于生物体内的功能性糖胺高分子聚合物,在日化、医疗和食品领域应用前景广阔.随着基因工程与代谢工程等合成生物学技术的发展,人们对HA的生物合成过程和机理解析越发深入的同时,也伴随一些新的挑战来临.该综述从分子生物学角度总结了HA的关键合成酶基因及合成途径,对不同来源的HA合成酶进行了氨基酸序列比对分析,并详细描述了HA在常用微生物宿主中生产的安全性、底物不平衡性、发酵低溶氧性等瓶颈问题及其相应的合成生物学策略开发,从而归纳出了目前微生物中高产HA的有效策略,为进一步推动HA的绿色生物制造提供了重要的科学依据和理论支撑.

目的 探究化合物M6所干预的谷氨酸棒状杆菌(Cg)基因表达网络,以期为深入研究M6的抗菌作用机制提供候选基因.方法 利用Chemdraw 18.0软件展示M6的分子结构,二倍稀释法测定M6在多种微生物中的抗菌谱;模式菌选用与MTB细胞壁相似的Cg,刃天青法测定M6的最低抑菌浓度(MIC);用转录组测序分析M6对Cg基因表达的影响,实验组和对照组分别用1/2 MIC浓度的M6和相同浓度的DMSO处理Cg 24 h,每组设3次生物学重复;Trizol法提取总RNA并进行转录组测序;利用Bewtie 2软件分析差异表达基因(DEGs),用GO功能和KEGG通路分析DEGs富集及功能,STRING分析DEGs表达蛋白质之间的互作关系.结果 大部分G-菌和真菌对M6耐受,G+菌对M6较敏感,特别是MTB最敏感(MIC为0.0625μg·mL-1);分子结构显示M6具备有限的分子构象.选用对M6敏感的Cg(MIC为0.5μg·mL-1)为模式菌进行后期的转录组测序,测序结果显示,M6干预使Cg差异表达的mRNA共452个(P≤0.05,|log2FC|≥1.0),其中346个高表达,106个低表达;差异倍数4倍以上的基因有40个,包括高表达的ctpA、ftn、dps、cmr、trxC和clpB等34个基因及6个低表达基因bioB、bioA、gip、hI-0095、DNA81和DNA345.GO功能富集分析显示,DEGs主要富集在核糖体结构组分、rRNA结合和核蛋白复合体等与核糖体相关的功能途径.KEGG通路功能分析显示,核糖体及阳离子抗菌肽耐药性通路中的DEGs富集程度最显著,以rplL、rplJ、rplQ、rpmD、ftn、dps、cmr、trxC、bioA和ugpE等差异性最大.在蛋白互作网络图中,位于中心节点的蛋白质所对应的基因分别为rplQ、rplJ、rspD、rpmD、rpoA、rplE和rplL等.结论 M6具备显著的抗MTB活性.在调控Cg的基因表达方面,主要影响了Cg的核糖体及阳离子抗菌肽耐药性通路相关多个基因的表达.

本文用正交设计原理研究了谷氨酸棒状杆菌产脲酶的培养条件和制作硝酸纤维素微囊（包埋完整细菌）的方法，并用脲酶微囊对实验性肾功能衰竭大鼠作了治疗观察。结果显示：脲酶活性20.34nmol/s/mg干重（1.22IU/mg干重）；微囊化后脲酶活性保留原活性的33%，稳定性明显提高。微囊化与非微囊化脲酶其最适pH是一致的，由于微囊具有抗蛋白水解酶和一定的耐酸能力，有利于在肠道中起作用。经肾功能衰竭大鼠使用后取得了一定的效果，BUN下降44%，且无血NH 3升高的副作用。