目的:利用超声靶向微泡破裂(UTMD)技术介导T细胞Itch基因沉默，观察T细胞免疫活性变化。方法:磁珠分选纯化T细胞，构建靶向Itch基因的短发夹RNA(shRNA)表达质粒。实验组为超声辐照＋Itch-shRNA质粒-SonoVue微泡，对照组为超声辐照＋阴性对照shRNA质粒-SonoVue微泡，空白组未处理。转染48 h，荧光显微镜和流式细胞术评估细胞转染效率，免疫印迹(Western blot)法检测Itch基因蛋白表达水平。转染72 h,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各组细胞上清液中白介素2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)水平。采用单因素方差分析比较多组间差异，两两比较LSD- t检验。 结果:利用UTMD技术介导shRNA转染效率达到52.3%，转染后实验组、对照组和空白组Itch相对蛋白表达量分别为0.301±0.080、0.773±0.101和0.719±0.090，实验组Itch蛋白表达显著降低，差异有统计学意义( F＝24.441， P<0.01)。转染72 h，实验组、对照组和空白组IL-2浓度分别为(417.3±37.1)ng/L、(158.7±17.3)ng/L和(147.0±10.2)ng/L，差异有统计学意义( F＝118.701， P<0.001)；IFN-γ浓度分别为(168.3±12.1)ng/L、(74.3±3.7)ng/L和(74.6±7.1)ng/L，差异有统计学意义( F＝126.833， P<0.001)；实验组IL-2和IFN-γ表达水平较对照组和空白组显著升高。 结论:利用UTMD技术介导Itch-shRNA转染能明显降低T细胞Itch水平，增强T细胞免疫活性。

目的 探讨普通电刀钳夹凝闭技术在兔甲状腺切除术中的应用效果及安全性.方法 按照随机数字表法将12只新西兰兔分为钳夹凝闭组和超声刀组,每组6只.钳夹凝闭组兔行普通电刀钳夹凝闭技术离断甲状腺中部,超声刀组兔行超声刀电凝离断甲状腺中部.观察2组兔术后一般情况.取切除后甲状腺组织行苏木精-伊红(HE)染色,光学显微镜下观察热损伤后甲状腺组织病理学,并测定热损伤范围;分别于术后第1、3、7天,抽取2组兔的耳缘静脉血,应用酶联免疫吸附测定法检测血清中白细胞介素-6(IL-6)、C反应蛋白(CRP)水平;术后第7天,处死2组兔,取残余甲状腺,行HE染色,光学显微镜下观察病理学变化及炎症细胞浸润情况.结果 2组兔术后均存活良好,术区愈合良好,残腔未见明显积液、凝血块,无术后出血、切口感染等并发症.光学显微镜下,甲状腺切缘表面可见明显损伤区域;损伤区域部分细胞结构受损,出现凝固性坏死,部分滤泡破裂,内容物呈固体浓缩和深染;滤泡旁细胞的胞质嗜酸性增加,核固缩、碎裂,甚至核溶解.超声刀组和钳夹凝闭组兔甲状腺组织的热损伤范围分别为(0.72± 0.10)、(0.88±0.11)mm;钳夹凝闭组兔甲状腺组织的热损伤范围显著大于超声刀组(t=-2.740,P＜0.05).术后第1、3、7天,钳夹凝闭组与超声刀组兔血清中CRP、IL-6水平比较差异无统计学意义(P＞0.05);2组兔术后第1、3、7天血清中CRP水平比较差异无统计学意义(P＞0.05);2组兔术后第3、7天血清中IL-6水平显著高于术后第1天(P＜0.05);术后第3天与第7天血清中IL-6水平比较差异无统计学意义(P＞0.05).2组兔的残余甲状腺断面均可见部分甲状腺腺体滤泡萎缩,胶质减少,滤泡上皮增生,间质纤维胶原化、增生,未见明显的炎症细胞浸润.结论 在兔甲状腺切除术中应用普通电刀钳夹凝闭技术离断甲状腺较为安全;在预防热损伤方面,超声刀优于普通电刀钳夹凝闭技术,但普通电刀钳夹凝闭技术导致的甲状腺组织热损伤范围在安全操作范围内.

目的 评价超声介导微泡破裂对利多卡因神经阻滞效果的影响.方法 清洁级雄性SD大鼠72只,体质量200~300g.随机分为6组(n=12):空白对照组(C组)、1%利多卡因水溶液组(L1组)、1%利多卡因+微泡组(LM1组)、2%利多卡因水溶液组(L2组)、2%利多卡因+微泡组(LM2组)和空白微泡组(M组).于大鼠坐骨神经阻滞前,阻滞后10、20、30、45min,1、2、4、6、8、10和12h进行感觉和运动评定.分别以感觉阻滞的最大可能效应(MPE)和大鼠后肢蹬力(EPT)评估感觉和运动阻滞程度.于大鼠坐骨神经阻滞前、阻滞后2天和1周时行改良Tarlov评分;于坐骨神经阻滞后1周行病理学观察,Western blot法测定坐骨神经S100表达水平.结果 与阻滞前相比,L1组在阻滞后10min~1h、LM1组和L2组在阻滞后10min~2h、LM2组在阻滞后10min~6h各时间点MPE升高(P<0.05);与L1组相比,LM1组MPE在阻滞后30min~2h升高(P<0.05);与L2组相比,LM2组MPE在阻滞后30min~6h升高(P<0.05).与阻滞前相比,L1组在阻滞后10min~45min、LM1组和L2组在阻滞后10min~1h、LM2组在阻滞后10min~2h各时间点EPT降低(P<0.05);与L1组相比,LM1组EPT在阻滞后30min~1h降低(P<0.05);与L2组相比,LM2组EPT在阻滞后45min~2h降低(P<0.05).与C组相比,L2和LM2组在阻滞后2天改良Tarlov评分较阻滞前降低(P<0.05).阻滞后1周时,L2组和LM2组可见轻度坐骨神经损伤,坐骨神经S100表达增加.结论 超声介导微泡破裂可以显著增强利多卡因神经阻滞强度,延长阻滞时间,且生物相容性良好.超声介导微泡破裂下2%利多卡因的坐骨神经阻滞效果优于1%利多卡因,但存在神经损伤的可能性.

超声是指频率高于20 kHz、能在连续性介质中传播的机械波.临床上超声不仅用于诊断疾病,也是康复理疗科常用的治疗手段,应用广泛,如治疗骨关节炎、炎症和感染、促进骨折愈合、软组织修复等.低频超声通常指频率在20kHz～1 MHz,相比高频超声(＞3 MHz)具有通透性强、声能吸收少、对组织损伤小的特点.低强度超声通常是指强度＜3 W/cm2的超声,与高能聚焦超声(high intensity focused ultrasound,HIFU)相比,低强度超声以其热损伤小、机械作用弱的优势常被用于治疗肿瘤.治疗用超声相关的生物学效应包括热效应、机械效应和空化效应,而低强度超声主要通过空化效应发挥作用.超声的空化效应分为非惯性空化(空泡的稳定震荡)和惯性空化(空泡增长与爆破)两种,非惯性空化会引起流体的运动,对周围组织产生剪切力和微射流;惯性空化会产生高温和冲击波,诱发压力梯度,使周围组织破裂,同时空泡爆破期间还会产生高活性物质如活性氧和自由基,会损伤细胞膜、蛋白质、核酸等维持细胞功能的大分子,导致细胞或周围组织的破坏.本文就超声治疗肿瘤的机制综述如下.

目的 利用超声介导微泡破裂技术(UTMD)沉默T细胞Itch基因表达,观察转染T细胞对肺腺癌细胞LA795的体外免疫杀伤效率.方法 磁珠分选纯化T细胞,构建靶向Itch基因的shRNA表达质粒,超声微泡介导转染48 h后,荧光显微镜和流式细胞仪评估细胞转染效率,Western blot检测Itch蛋白表达.转染72 h后,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中IL-2和IFN-γ分泌水平,观察对比单纯T细胞、阴性对照T细胞及转染T细胞与小鼠肺腺癌细胞LA795共培养时肿瘤杀伤率.结果 利用UTMD技术介导shRNA转染效率达到52.3% ±3.8%,Itch蛋白表达能够有效被抑制.转染72 h后,超声微泡介导沉默Itch基因显著增加T细胞因子IL-2和IFN-γ分泌水平(P<0.05);与空白组或阴性对照组T细胞相比,在不同的靶效比水平(10 : 1、20 : 1、40 : 1),转染T细胞杀瘤活性均明显增高(P<0.05).结论 利用UTMD技术介导shRNA转染能有效沉默Itch基因表达,促进T细胞免疫活性,增强T细胞对小鼠肺腺癌细胞LA795的体外免疫杀伤效率.

目的 乳腺癌发生发展与机体免疫水平有密切关系,而Cbl-b基因可作为抗肿瘤治疗的免疫靶点.利用超声介导微泡破裂技术(ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)沉默T细胞Cbl-b基因表达,观察转染T细胞对4T1乳腺癌细胞的体外免疫杀伤效率.方法 磁珠分选纯化T细胞,构建靶向Cbl-b基因的短发夹RNA(short-hair-pin RNA,shRNA)表达质粒,超声微泡介导转染48 h后,荧光显微镜和流式细胞仪评估细胞转染效率,蛋白质印迹法检测Cbl-b蛋白表达情况.转染72 h后,利用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)比较各组细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)分泌水平.转染72 h后,观察对比单纯T细胞、阴性对照T细胞及转染T细胞与小鼠4T1乳腺癌细胞共培养时肿瘤杀伤效率.结果 原代培养T细胞纯度为93.7％.利用UT-MD技术介导shRNA转染效率达到61.3％.qPCR和蛋白质印迹法检测结果显示,Cbl-b基因和蛋白水平表达均能被有效抑制.与空白组(1.007±0.022)相比,实验组Cbl-b mRNA表达量(0.333±0.046)明显降低,P<0.001;实验组、对照组和空白组Cbl-b蛋白相对表达量分别为0.301±0.080、0.773±0.101和0.719±0.090,检验统计量组间总变异,F=38.751,P<0.001;实验组Cbl-b蛋白表达显著降低.与空白组〔(74±6)pg/mL〕相比,实验组T细胞因子TNF-α分泌〔(157±26)pg/mL〕水平明显升高,P=0.001.转染72 h后,与空白组及阴性对照组T细胞相比,在15:1(P=0.046)、30:1(P=0.028)和60:1(P=0.003)的效靶比水平,转染T细胞杀瘤活性均明显增高.结论 利用UTMD技术介导shRNA转染能有效沉默Cbl-b基因表达,促进T细胞免疫活性,增强T细胞对小鼠4T1乳腺癌细胞的体外免疫杀伤效率.

目的 利用超声介导微泡破裂技术(UTMD)沉默T淋巴细胞Itch基因表达,观察转染T细胞对胃癌MFC细胞的免疫杀伤效率.方法 免疫磁珠分离T淋巴细胞,构建靶向Itch基因的shRNA表达质粒,超声微泡介导转染48 h后,流式细胞仪分析T细胞转染成功率,Western blot测定T细胞Itch蛋白表达.转染24 h后,流式细胞仪检测T淋巴细胞活化早期标志CD69表达.转染72 h后,观察对比单纯T淋巴细胞、阴性对照T淋巴细胞及转染T淋巴细胞与小鼠胃癌MFC细胞共培养时肿瘤杀伤率.结果 利用UTMD技术介导shRNA转染效率达到51.9％, Itch蛋白表达能被有效抑制.转染24h后,转染组T淋巴细胞早期活化标志CD69表达较其他组更高.转染72 h后,与阴性对照组和空白组相比,在不同的效靶比水平(10: 1、 20: 1、40: 1), 转染T淋巴细胞杀瘤活性均增强.结论 利用UTMD技术介导shRNA转染能有效沉默 Itch基因表达,促进T淋巴细胞免疫活性,增强T淋巴细胞对胃癌MFC细胞的免疫杀伤效率.

目的:探讨超声靶向破裂技术介导载脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)基因阳离子微泡(brain-derived neurotrophic factor-loaded cationic nanobubbles,BDNF/CNBs)治疗大鼠急性不完全脊髓损伤的可行性及效果.方法:96只成年雄性SD大鼠构建急性不完全脊髓损伤模型(Allen法)后随机分为4组:生理盐水(normal saline,NS)组;载BDNF基因阳离子微泡(BDNF/CNBs)组;BDNF基因+超声(brain-derived neurotrophic factor+ ultrasound,BDNF+US)组;载BDNF基因阳离子微泡+超声(BDNF/CNBs+ US)组,每组24只.经大鼠尾静脉注射药物后再按上述分组进行处理,在不同时间点采用HE染色观察脊髓损伤后的病理变化;Nissl染色观察神经元存活及再生情况;TUNEL染色法检测神经元凋亡情况;采用RT-PCR和Western blot检测BDNF基因和蛋白的表达情况;通过倒置荧光显微镜观察偶联绿色荧光蛋白的表达情况;最终采用BBB法(Basso,Beattie,and Bresnahan test,BBB)评估大鼠神经功能恢复情况.结果:本实验所制备的BDNF/CNBs阳离子超声微泡的平均粒径为(339.8±210.3) nm,Zeta电位为(24.30±6.24)mV.BDNF/CNBs+ US治疗组能有效减轻脊髓组织损伤,明显增加BDNF基因及BDNF蛋白的表达(0.61±0.10 vs.0.70±0.13 vs.0.83±0.15 vs.1.55±0.19,P=0.000;31.65±1.30 vs.45.62±1.50 vs.49.55±1.20 vs.75.83±2.10,P--0.000);与对照组相比,BDNF/CNBs+US治疗组尼氏小体数量明显增多(51.00±4.95vs.90.80±6.87 vs.99.60±7.50 vs.159.40±8.56,P=0.000),神经元凋亡数明显减少(60.19±1.84 vs.54.97±2.40 vs.36.70±2.23 vs.17.08±1.42,P=0.000);且最终促进脊髓损伤后神经功能的恢复,即表现为明显增高的BBB评分(10.10±0.33 vs.10.60±0.43 vs.11.70±0.36 vs.17.20±0.45,P=0.000).结论:载BDNF阳离子超声微泡联合超声靶向微泡破裂治疗能有效地将BDNF基因转染入损伤脊髓组织,并能促进脊髓损伤的功能恢复.以BDNF/CNBs为基础的超声辐照联合基因治疗在治疗脊髓损伤及其他中枢神经系统疾病方面有广阔的应用前景,为脊髓损伤的治疗提供了一种新型、安全的方法.

高强度聚焦超声( high intensity focused ultrasound,HIFU) 20世纪中期被用于治疗神经紊乱疾病的探索[ 1 ].然而由于技术问题,直到20 世纪90年代超声介导设备及实时成像等技术得到改善, HIFU才被重新应用于肿瘤的治疗.HIFU 介导的肿瘤消融,采用一定的聚焦方式将体外低能量的超声波聚焦到体内形成一个能量高度集中的区域,应用HIFU的热效应和空化效应使靶点组织失去生物学活性.HIFU的热效应包括一般加热、致组织凝固性坏死和组织汽化.空化效应是HIFU治疗过程中除热效应外的又一关键生物效应.超声波作用于液体介质时,液体中的微小气泡会在超声波的作用下表现出振荡、生长、压缩和崩溃等一系列动力学过程,此称声空化(简称空化),空化效应的存在使高强度超声波在靶点处形成气泡,气泡的崩溃破裂可在附近微小的区域内产生高压冲击波( 20 ～30000 bars)及高温(2000～5000 K) [2] ,损伤周围微小范围内的组织,进一步加强 HIFU 对组织的消融作用.基于超声波的穿透性,HIFU可以穿透皮肤聚焦于靶点,从而实现无创消融组织.

目的:观察温经汤对子宫内膜异位症(EMs)大鼠缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达及线粒体超微结构的影响,探讨温经汤治疗EMs的作用机制.方法:采用自体内膜移植法复制大鼠EMs模型,小动物超声成像系统检测异位病灶体积,依据体积均衡原则随机分为模型组、温经汤低、中、高剂量组(4.85,9.7,19.4 g·kg-1)及孕三烯酮组(0.25 mg· kg-1),每组10只,另设假手术组10只.药物治疗6周后,超声成像系统及卡尺分别测量异位病灶体积,苏木素-伊红(HE)染色观察异位内膜组织形态,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测腹腔液白细胞介素-1β(IL-1β),肿瘤坏死因子-α(TNF-α),转化生长因子-卢1(TGF-β1)水平,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测在位或异位内膜组织HIF-1α mRNA及蛋白表达,透射电镜观察异位内膜线粒体超微结构.结果:与假手术组比较,模型组可见异位病灶生成,呈囊泡样结构,病灶内可见典型的子宫内膜组织形态,IL-1β,TNF-α,TGF-β1含量显著升高(P＜0.01),HIF-1αmRNA及蛋白表达水平明显升高(P＜0.05,P＜0.01),透射电镜可见异位内膜胞浆中线粒体数量增加,结构完整;与模型组比较,温经汤各剂量组异位病灶体积显著降低(P＜0.01),且超声检测结果与卡尺测量结果大体一致,HE染色可见异位内膜柱状上皮细胞破损或脱落、间质细胞疏松;温经汤各剂量组TNF-α含量明显降低,温经汤中、高剂量组IL-1β,TGF-β1含量明显降低(P＜0.05,P＜0.01);温经汤各剂量组还可明显降低HIF-1αmRNA及蛋白表达(P＜0.05,P＜0.01);且温经汤治疗后异位内膜线粒体明显肿胀,嵴断裂甚至消失,部分线粒体空泡变性,外膜破裂.结论:温经汤对大鼠实验性EMs具有较好的治疗作用,机制与降低HIF-1α表达,改善异位病灶乏氧,诱导异位内膜线粒体损伤有关.