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超声联合载BDNF逆转录病毒微泡开放血脑屏障治疗阿尔茨海默病
编辑人员丨3天前
目的:制备载脑源性神经营养因子(BDNF)逆转录病毒超声微泡(MpLXSN-BDNF),探讨其联合超声开放血脑屏障对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠的治疗作用。方法:成年雄性SD大鼠32只,随机分为4组:超声+载pLXSN-EGFP微泡组(U+MpLXSN-EGFP组)、超声+载pLXSN-BDNF微泡组(U+MpLXSN-BDNF组)、超声+微泡+pLXSN-BDNF病毒组(U+M+pLXSN-BDNF组)和对照组(Normal组),每组8只。脑内注射β-淀粉样蛋白1-40建立AD大鼠模型,U+MpLXSN-EGFP组、U+MpLXSN-BDNF组、U+M+pLXSN-BDNF组大鼠分别经尾静脉注射载pLXSN-EGFP的微泡、载pLXSN-BDNF的微泡、pLXSN-BDNF病毒和微泡;上述3组注射完成后采用磁共振引导的低频聚焦超声辐照大鼠左侧海马区开放血脑屏障,Normal组不进行处理。处理前、处理1个月后,各组大鼠采用Morris水迷宫实验评价大鼠行为学改变。采用免疫组化法和高效液相色谱法检测大鼠海马组织乙酰胆碱转移酶(ChAT)阳性细胞数目及乙酰胆碱(ACh)含量。结果:Morris水迷宫实验显示,与处理前比较,处理1个月后U+MpLXSN-BDNF组大鼠穿越平台次数明显增多( P<0.05);其余3组处理前后穿越平台次数比较,差异均无统计学意义(均 P>0.05)。免疫组化和高效液相色谱法检测显示,与U+MpLXSN-BDNF组比较,U+MpLXSN-EGFP组和U+M+pLXSN-BDNF组大鼠海马组织ChAT阳性神经元数目和Ach含量均明显减少(均 P<0.05)。 结论:超声联合载BDNF病毒微泡可增加脑内神经细胞的转染效率,促进外源基因BDNF高表达,对AD模型大鼠起到治疗作用。
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编辑人员丨3天前
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基于TLR4/NF-κB信号通路探讨金雀异黄酮对膜性肾病大鼠肾损伤的影响
编辑人员丨2024/4/13
目的 探讨金雀异黄酮对膜性肾病大鼠肾损伤及Toll样受体4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)信号通路的影响.方法 从45 只SD大鼠中随机取8 只作为正常组,剩余大鼠采用尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)的方法构建膜性肾病模型.将 32 只成模大鼠随机分为模型组、金雀异黄酮组、瑞沙托维组和金雀异黄酮+瑞沙托维组,每组8 只.金雀异黄酮组给予金雀异黄酮30 mg/kg腹腔注射,瑞沙托维组给予瑞沙托维10 mg/kg腹腔注射,金雀异黄酮+瑞沙托维组分别给予金雀异黄酮30 mg/kg和瑞沙托维10 mg/kg腹腔注射,均1 次/d,干预4 周.检测肾功能指标[24 h尿蛋白、血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、血浆白蛋白];HE染色、Masson染色和透射电子显微镜观察肾组织病理学形态、胶原沉积情况及细胞超微结构;免疫荧光染色法观察肾组织中免疫球蛋白G(IgG)沉积情况;ELISA法检测肾组织中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;RT-PCR法检测肾组织中TLR4、NF-κB p65、转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA表达情况,Western blot法检测肾组织中TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白表达情况.结果 与正常组比较,模型组大鼠24h 尿蛋白、BUN、SCr水平均明显升高(P均<0.05),血浆白蛋白水平明显降低(P均<0.05);肾小球体积增大,肾小管细胞空泡样变,间质区炎性细胞浸润,间质区和肾小球大量胶原沉积,胶原容积分数明显升高(P<0.05);肾小球细胞肿胀,足突融合或消失,基底膜不规则增厚,上皮细胞下可见大量电子致密物沉积,IgG大量沉积;肾组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平及TLR4、NF-κB p65、TGF-β1 mRNA相对表达量和TLR4、NF-κB p65、TGF-β1、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)、p-Smad2/3 蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),肾组织中Smad7 蛋白相对表达量明显降低(P<0.05).与模型组比较,各药物组大鼠24h 尿蛋白、BUN、SCr水平均明显降低(P 均<0.05),血浆白蛋白水平均明显升高(P 均<0.05);肾组织病理学改变、细胞超微结构改变均明显减轻,胶原容积分数明显降低(P均<0.05),IgG沉积量明显减少;肾组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平及TLR4、NF-κB p65、TGF-β1 mRNA相对表达量和TLR4、NF-κB p65、TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、p-Smad2/3 蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),Smad7 蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05).与金雀异黄酮组和瑞沙托维组比较,金雀异黄酮+瑞沙托维组肾损伤更轻,各检测指标改善情况更明显(P均<0.05).结论 金雀异黄酮可明显改善膜性肾病大鼠肾功能,减轻肾损伤,其机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路,减轻炎症反应和肾纤维化有关.
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编辑人员丨2024/4/13
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基于多肽-泊洛沙胺纳米颗粒载体的呼吸道黏膜mRNA疫苗研究
编辑人员丨2023/8/19
目的 设计并制备mRNA-多肽-泊洛沙胺纳米颗粒(mRNA peptide polymer ternary complex,mRNA-PPTC),考察其理化特性、体外和体内呼吸道组织相关细胞递送效率、免疫后小鼠特异性抗体诱导能力.方法 通过体外转录分别制备编码萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,F-luc)、增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和新冠病毒受体结合域蛋白(receptor binding domain,RBD)的mRNA,利用动态光散射法检测mRNA-PPTC的粒径、多分散系数、Zeta电位.通过透射电镜观察纳米颗粒形态.将F-luc mRNA-PPTC及对照组制剂分别转染至人支气管上皮细胞(16 human bronchial epithelial cell,16HBE)、鼠源树突状细胞(dendritic cell 2.4,DC2.4)、鼠源巨噬细胞(mouse leukemia cells of monocyte macrophage,RAW264.7),检测荧光素酶报告基因转染效率和细胞活性;将EGFP mRNA-PPTC及对照组制剂转染至16HBE细胞,使用荧光显微镜观察EGFP表达情况.利用活体成像技术考察F-luc mRNA-PPTC在小鼠呼吸道的转染效率.选用编码RBD蛋白的mRNA作为疫苗抗原模型,通过酶联免疫吸附实验检测免疫后小鼠血清中抗原特异性免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)和支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中抗原特异性分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)水平.结果 成功制备粒径约100 nm近球形且均一稳定的弱阳离子mRNA-PPTC纳米颗粒;mRNA-PPTC能有效转染16HBE、DC2.4、RAW264.7细胞,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),并且细胞毒性较低;mRNA-PPTC通过滴鼻免疫后,在小鼠鼻部和肺组织中检测到F-luc报告基因的有效表达,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);在初免后第28天的小鼠血清和BALF样品中,能分别检测到高效价的RBD抗原特异性IgG和sIgA,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05).结论mRNA-PPTC纳米颗粒有良好的体外mRNA递送能力且细胞毒性较低;滴鼻给药后在小鼠上下呼吸道均能高效表达目的基因;小鼠滴鼻免疫后能产生高水平的抗原特异性血清IgG和支气管肺泡灌洗液sIgA.
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编辑人员丨2023/8/19
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血管内皮靶向微泡对兔心肌缺血再灌注损伤的超声分子显像
编辑人员丨2023/8/6
目的:构建针对血管内皮细胞损伤的靶向微泡,实现对兔心肌缺血再灌注损伤的靶向显像.方法:构建血管内皮细胞间黏附分子-1(ICAM-1)靶向阳离子微泡(TCMB)和非靶向普通阳离子微泡(CMB),肿瘤坏死因子α(TNF-α)活化培养至70%融合的原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)/脐静脉,CMB和TCMB分别以2.0 dynes/cm2的剪切应力通过平行板流动腔连接的细胞培养皿/脐静脉,比较CMB和TCMB对HUVEC/脐静脉的靶向粘附能力.20只新西兰大耳兔随机分为CMB组和TCMB组,每组各10只,参照相关文献方法制备心肌缺血再灌注损伤模型,耳缘静脉注射1ml浓度均为2×108个/ml的CMB(CMB组)和FITC二抗标记的TCMB(TCMB组),比较CMB和TCMB对兔心肌缺血再灌注损伤的靶向显像能力.结果:CMB与TCMB的粒径差异无统计学意义(2.90±1.90μmvs 3.10±2.10μm,P>0.05),CMB表面电位高于TCMB(+31.30±3.90mV vs +22.00±2.40mV,P<0.01).与活化血管内皮细胞粘附的TCMB数量是CMB的19.4倍,与脐静脉粘附的TCMB声强度是CMB的3倍,差异均有统计学意义(P<0.01).TCMB可在兔心肌缺血再灌注损伤区域的冠脉内定向聚集,实现靶向超声分子显像,而CMB无明显靶向显像功能;TCMB组兔损伤区域心肌声强比是CMB组的1.86倍,差异有统计学意义(P<0.01).结论:ICAM-1靶向微泡能与损伤的血管内皮细胞特异性粘附,实现对心肌缺血再灌注损伤的靶向超声分子显像.
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编辑人员丨2023/8/6
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恢复connexin26表达联合载酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因纳泡杀灭膀胱癌细胞
编辑人员丨2023/8/6
目的 分析载双基因的阳离子纳泡联合超声靶向微泡破坏技术进行基因转染的有效性,探索恢复或上调膀胱癌细胞的缝隙连接蛋白connexin26(Cx26)表达,能否增强自杀基因系统(yeast cytosine deaminase/5-fluorocytosine,YCD/5-FC)的旁观者效应,提高杀灭肿瘤细胞的效率.方法 阳离子纳泡结合超声辐照(US)转染人膀胱癌T24细胞,荧光显微镜及流式细胞仪观测转染效率;qRT-PCR和Western blot检测质粒转染后的mRNA或蛋白相对表达量.将实验分为兀处理空白对照、载pcDNA3.1-EGFP纳泡组、载Cx26纳泡组、载YCD纳泡组、载YCD+ Cx26纳泡组;通过流式细胞术观察恢复Cx26表达后对膀胱癌细胞凋亡的影响.结果 qRT-PCR、Western blot显示纳泡结合超声辐照成功将目的基因转染并有效表达.恢复Cx26表达后,载YCD+Cx26纳泡组的细胞凋亡率为(60.68±2.61)%,明显高于单载YCD纳泡组的(46.42±2.13)%,差异有统计学意义(P<0.01).结论 恢复缝隙连接蛋白Cx26表达,可改善细胞间通讯连接,加强自杀基因系统YCD/5-FC的旁观者效应,促进肿瘤细胞凋亡,提高杀灭膀胱癌细胞的效率.
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编辑人员丨2023/8/6
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阳离子微泡提高超声波靶向击碎微泡技术体内基因靶向转染效率及治疗效果的实验研究
编辑人员丨2023/8/6
目的 构建一种阳离子微泡(cationic microbubble,CMB),通过与传统微泡(definity microbubble,DMB)比较,探讨其提高超声波靶向击碎微泡(ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)技术介导的体内基因转染效率及治疗效果.方法 体外实验:应用薄膜水化法制备CMB,观察其形态、测量其粒径、zeta电位以及基因携带能力,以DMB作为对照.体内实验:首先取16只大鼠以生物荧光素酶质粒作为报告基因,分别应用CMB和DMB进行心脏的靶向转染,动态观察转染效率及靶向性.随后取64只大鼠制备心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)模型,第5天彩色超声检查明确60只大鼠成功制备I/R模型;随机分为3组(n=20),其中对照组大鼠接受DMB携带空质粒转染,DMB组接受DMB携带AKT质粒转染,CMB组接受CMB携带AKT质粒转染.治疗后心脏彩色超声以及组织学观测各组大鼠心肌灌注、心脏功能、梗死区面积和梗死区组织厚度;免疫组织化学染色检测毛细血管及小动脉密度,TUNEL染色观察心肌细胞凋亡;Western blot检测心肌AKT、磷酸化AKT (phospho-AKT,P-AKT)、生存素(Survivin)和磷酸化BAD (phospho-BAD,P-BAD)表达.结果 实验制备的CMB形状均一,其zeta电位显著高于DMB(t=28.680,P=0.000);DNA携带百分比显著高于DMB (P<0.05).无论在体检测还是离体检测均显示,应用CMB转染后的荧光素酶活性均显著高于DMB转染后,差异有统计学意义(P<0.05).I/R模型术后第5天,各组前、后壁信号强度比值以及心脏射血分数、左室短轴缩短率比较,差异均无统计学意义(P>0.05);第21天,CMB组及DMB组以上指标较对照组增加,且CMB组高于DMB组,差异均有统计学意义(P<0.05).术后第21天,CMB组梗死区域长度最小、厚度最大,其次为DMB组、对照组;CMB组及DMB组毛细血管、小动脉血管密度均较对照组明显增大,CMB组较DMB组增大,组间差异均有统计学意义(P<0.05).基因转染后第3天,对照组凋亡细胞最多,其次为DMB组、CMB组;CMB组及DMB组AKT、P-AKT、Survivin和P-BAD蛋白相对表达量均明显高于对照组,CMB组高于DMB组;组间比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 CMB在保留了普通微泡理化性质的同时,显著提高了携带质粒DNA的能力,提高了超声微泡靶向转染效率;应用CMB进行超声靶向AKT基因转染治疗大鼠心肌I/R损伤时,显著提高了基因转染率,改善了大鼠心脏功能.
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编辑人员丨2023/8/6
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超声联合靶向阳离子微泡介导Ang-1基因转染改善兔缺血心肌功能
编辑人员丨2023/8/6
目的:构建靶向阳离子微泡作为基因载体,增强超声靶向微泡破坏(UTMD)介导血管新生基因转染家兔心肌组织的效率,从而提高心肌梗死的疗效.方法:构建家兔心肌梗死模型,制备细胞间黏附分子(ICAM)1靶向阳离子微泡(TCMB)和非靶向普通阳离子微泡(CMB),以生理盐水为空白对照(Control),将家兔分为3组:TC-MB治疗组,CMB治疗组和Control组,在UTMD作用下分别介导血管生成素-1(Ang-1)基因转染家兔心肌组织,比较三组转染效率及心功能.结果:CMB与TCMB的粒径无明显差异[(2.9±1.9) μm vs (3.1±2.1) μm,P>0.05],二者表面电位分别为(+31.3±3.9) mV和(+22.0±2.4) mV (P<0.01),每千万个微泡的载基因量分别为(3.3±0.7)μg和(4.0±0.9) μg(P<0.05).转染治疗后3d,TCMB组的Ang-1基因表达高于CMB组,CMB组高于Control组(均P<0.05).与心梗后2d相比,转染治疗后28 d,Control组左室射血分数LVEF进一步减低[(44±10)%],而CMB组和TCMB组均有所改善,但以TCMB组显著[(59±7)% vs (54±8)%,P<0.05].结论:ICAM-1靶向阳离子微泡能增加载基因能力及靶向性,提高UTMD介导Ang-1基因转染的效率,改善兔缺血心肌功能.
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编辑人员丨2023/8/6
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超声介导载miR-34a脂质微泡对宫颈癌抑制作用的体内实验研究
编辑人员丨2023/8/6
目的 探讨超声介导载miR-34a脂质微泡对小鼠U14宫颈癌皮下移植瘤的抑制作用.方法 (1)制备载miR-34a阳离子脂质微泡,检测其一般特性;(2)建立小鼠U14宫颈癌皮下移植瘤模型,随机分组为对照组、空阳离子脂质微泡组、载miR-34a阳离子脂质微泡组;(3)根据分组给予微泡+超声辐照的处理,绘制各组肿瘤生长曲线,计算抑瘤率,实时荧光定量PCR技术检测miR-34a、c-met、bax基因表达情况,免疫组织化学法检测c-Met、Bax蛋白表达情况.结果 (1)微泡镜下呈球形,平均粒径(1.2±0.24)μm.(2)载miR-34a阳离子脂质微泡组小鼠肿瘤生长较其他小组缓慢,肿瘤体积明显较小(P<0.05),Bax表达上调,c-Met表达下调(P<0.05).结论 超声介导载miR-34a阳离子脂质微泡可明显抑制小鼠U14宫颈癌皮下移植瘤生长,促进肿瘤细胞凋亡.
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编辑人员丨2023/8/6
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超声靶向击碎微泡技术介导P-选择素靶向阳离子超声微泡改善人血管内皮生长因子165基因转染缺血心肌的实验性研究
编辑人员丨2023/8/6
目的:构建一种靶向阳离子微泡,探讨其提高超声靶向击碎微泡技术(TCUMGT)介导的体内基因转染效率及治疗效果.创新点:提出运用TCUMGT介导的基因转染技术,利用微泡的携基因和靶向定位释放双项功能来上调缺血区的人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的表达水平,发挥其成血管作用,从而改变缺血心肌的存活性.方法:通过聚乙二醇40硬脂酸酯、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、pcDNA3.1-hVEGF165和抗P-选择素单克隆抗体等制备P-选择素靶向阳离子微泡.微泡分成四组:(1)仅微泡(MB);(2)微泡+P-选择素(MB+P);(3)微泡+pcDNA3.1-hVEGF165质粒(MB+VEGFp);(4)微泡+P-选择素+pcDNA3.1-hVEGF165质粒(MB+P+VEGFp).逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)结果显示:TCUMGT成功转染hVEGF165基因,并且通过P-选择素为靶点可以提高转染效率.另外与其他组相比,MB+P+VEGFp组的心肌血管密度增加和心功改善最为明显.结论:本研究表明,通过TCUMGT技术,靶向超声微泡可以有效识别缺血心肌,释放pcDNA3.1-hVEGF165重组质粒,提高心肌微环境,促进心肌功能的恢复.
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编辑人员丨2023/8/6
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钛表面儿茶酚化聚电解质多层膜对蛋白质的吸附研究
编辑人员丨2023/8/6
目的 探讨钛表面儿茶酚化聚电解质多层膜对蛋白质的吸附行为,为钛种植体表面改性提供参考.方法 根据本课题组前期建立的方法,采用脂多糖胺纳米囊泡(NPs)和3,4-二羟苯基丙酸反应制备儿茶酚接枝率为40%的儿茶酚化NPs(cNPs);采用透明质酸(HA)和多巴胺反应制备儿茶酚接枝率为10%的儿茶酚化透明质酸(cHA).利用层层自组装技术,以cNPs为引发层、cHA/NPs为阴、阳离子聚电解质,在钛或石英表面构建含3个(cHA/NPs)双层的儿茶酚化聚电解质膜[(基底-cNPs-(cHA/NPs)3],记为cPEM.同时以NPs为引发层,构建含(HA/NPs)3的未儿茶酚化聚电解质膜(PEM).采用红外光谱分析膜表面化学组成、激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测膜表面粗糙度,Zeta电位分析仪记录膜表面Zeta电位.选取4种等电点(pI)分别小于、等于、大于生理pH 7.4的蛋白质:牛血清白蛋白(BSA,pI=4.7)、纤连蛋白(Fn,pI=5.8)、牛血红蛋白(BHb,pI=6.8~7.0)、多聚赖氨酸(PLL,pI=9.74),以其为模型蛋白,用0.15 mol/L的NaCl配制成1 mg/mL的水溶液.采用石英晶体微天平(QCM)实时动态监测膜表面蛋白吸附情况、原子力显微镜观察样品蛋白吸附前后形貌,LSCM、荧光酶标仪分别分析荧光标记蛋白在膜表面吸附情况,并测试荧光标记蛋白的吸附量.使用SPSS 20.0对数据进行单因素方差分析、SNK和LSD法进行比较,P<0.05认为差异有统计学意义.结果 LSCM结果表明,石英表面粗糙度为(301±12)nm,组装cPEM、PEM后,表面粗糙度增加,分别为(656±88)、(446±25)nm,组间差异具有统计学意义(F=66.974,P<0.001).cPEM组的红外谱图中出现儿茶酚中的苯环(νC=C)、PEM组的胺基和烷基、多糖中的糖醛酸环等特征峰,证实钛表面引入cPEM和PEM.组装过程中Zeta电位呈锯齿状交替上升,cPEM组表面电位为+22.53 mV,PEM组的表面电位为+17.36 mV.QCM结果表明,生理pH下,所有表面均基本不吸附PLL.在不同表面,BSA和BHb的吸附量cPEM组>PEM组>Ti组.原子力显微镜下可见cPEM、PEM组表面为分布均匀的水滴形海岛状结构,吸附BSA后,表面可见圆盘状结构,且cPEM组量大于PEM组,说明可能BSA在cPEM组表面的吸附量大于PEM组.采用LSCM和荧光酶标仪分析绿色荧光标记蛋白在不同表面的吸附情况,发现在不同种膜表面,同一蛋白吸附量cPEM组>PEM组>Ti组;在同一种膜表面,不同蛋白吸附量BSA>Fn>BHb.结论 本实验研发的聚电解质多层膜对钛表面进行改性后,能提高蛋白在表面的吸附,儿茶酚化改性则进一步促进这种吸附.蛋白吸附的驱动力可能主要源于静电相互作用和儿茶酚基团对蛋白偶联捕捉作用.
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编辑人员丨2023/8/6
