目的:探讨超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(HCN4)在大鼠体内和体外心肌成纤维细胞、心肌细胞中的表达分布及其增龄变化.方法:SD大鼠分为新生组(1～3 d),成年组(17个月)和老年组(22个月),每组8只,其中4只用于冰冻切片,另4只用于PCR;取新生SD大鼠心,酶消化法分离培养原代心肌成纤维细胞和原代心肌细胞.用免疫荧光、免疫组织化学检测原代心肌成纤维细胞和原代心肌细胞HCN4的表达;免疫印迹、实时荧光定量PCR检测原代心肌成纤维细胞HCN4的表达,用实时荧光定量PCR检测不同月龄大鼠心肌组织HCN4的表达.结果:体外细胞培养显示,成纤维细胞和原代心肌细胞中均表达HCN4.组织切片显示,新生、成年和老年大鼠心肌成纤维细胞和部分心肌细胞表达HCN4.P1～P4代成纤维细胞的免疫印迹和实时荧光定量PCR结果显示HCN4随着成纤维细胞代次增加,表达量逐渐降低;不同月龄大鼠左心室的实时荧光定量PCR结果显示随着大鼠月龄增加,HCN4的表达量逐渐降低,其结果与培养的细胞表达一致.结论:HCN4在心肌成纤维细胞和部分心肌细胞中表达.随增龄变化,心肌细胞和成纤维细胞HCN4的表达量逐渐下降.

目的 制备与临床发病机制相关且重现性好的缺血性心动过缓模型.方法 雄性SD大鼠18只,随机分为左冠状动脉结扎组、右冠状动脉结扎组和假手术组,每组6只.麻醉开胸,心电图监护下结扎左、右冠状动脉分支,分别在术后第5天(d5),d10和d15记录Ⅱ导联心电图,观察心电图和心率的变化;d16测量大鼠血流动力学参数,评价大鼠心功能;大鼠处死后,剪取含窦房结的右心房组织,HE和Masson染色观察右心房组织形态改变;Western蛋白印迹法测定右心房钠钙交换蛋白1(NCX1)和超极化激活环核苷酸门控阳离子通道亚型4(HCN4)蛋白的表达.结果 与假手术组相比,结扎左、右冠状动脉大鼠心电图ST段均抬高(P＜0.01),右冠状动脉结扎上升幅度较左冠状动脉结扎小(P＜0.01);右冠状动脉结扎大鼠术后心率持续降低,d10后心率低于假手术对照组(P＜0.05);左冠状动脉结扎大鼠术后心率呈升高回落趋势,d5心率高于假手术对照组(P＜0.05),然后回落,d15回落到假手术组水平;左冠状动脉结扎后15d,大鼠左心室内压最大下降速率明显下降(P＜0.01),左心室终末舒张压显著上升(P＜0.01);右冠状动脉结扎术对血流动力学指标均无明显影响.组织形态检查结果显示,右冠状动脉结扎引起右心房炎性浸润和纤维化更为明显(P＜0.01);Western蛋白印迹结果显示,右心房组织(包含窦房结)NCX1和HCN4表达显著降低(P＜0.05).结论 大鼠右冠状动脉结扎,引起右心房缺血性改变,成功制备了缺血性心动过缓模型.

目的 探讨超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(HCN4)在不同发育时期大鼠心肌组织中各类细胞的表达规律,为进一步研究HCN4对心肌的作用提供形态学依据.方法 出生1d、1月、3月、6月健康SD大鼠各15只.取新鲜心脏,石蜡切片和冷冻切片,利用免疫组织化学和荧光技术观察不同发育时段大鼠心肌组织HCN4阳性细胞的表达分布情况及形态学特征.利用Western blotting技术观察左右心室HCN4的蛋白含量.结果 免疫组织化学和荧光染色结果显示,HCN4阳性细胞在出生后1d、1月、3月、6月的血管平滑肌细胞,心内膜和血管的内皮细胞,心外膜的间皮细胞、成纤维细胞,大量心房肌细胞和少量心室肌细胞、传导组织细胞均有表达,但不同部位的表达细胞数量不均;Western blotting结果显示,心室HCN4蛋白随着月龄的增加表达逐渐降低.结论 HCN4在大鼠心肌组织中的表达随年龄的增加逐渐下降,但增殖能力较强的细胞持续存在,提示HCN4可能对心肌组织中的多种细胞的生存起调控作用.

目的 研究超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4种亚型(HCN1～4)在大鼠脊髓背角的分布特点,以及其在部分坐骨神经结扎术(PSNL)所致的慢性神经病理性疼痛动物模型中的表达变化.方法 首先,选取SD大鼠(150 ～250 g)制作L4-5段脊髓横切片,用免疫组织化学方法观察HCN1 ～4在大鼠脊髓背角的分布特点.其次,采用荧光定量PCR技术,检测大鼠L4-5段脊髓背角组织HCN1 ～4 mRNA的表达特点.另取同龄大鼠,将其随机分为模型组(PSNL组)和假手术组(sham组),每组4只.测定两组大鼠术前,术后1、3、7、10及14d术侧机械痛阈值(PWT),并于术后14 d取其脊髓背角组织检测HCN1 ～4 mRNA的表达变化.结果 免疫组织化学结果显示,HCN1 ～4通道蛋白在脊髓背角均有分布,但在Ⅰ～Ⅱ层分布最多,Ⅲ～Ⅵ层分布较少.荧光定量PCR结果显示,生理情况下脊髓背角HCN2 mRNA的表达量最高,其次是HCN1,而HCN3和HCN4表达量较少.与sham组相比,PSNL组PWT显著降低,且术后第14天HCN2 mRNA的表达量显著增加(P＜0.05),而HCN1、HCN3及HCN4表达量的变化差异无统计学意义(P＞0.05).结论 HCN1～4在正常大鼠脊髓背角具有特异性表达,但仅HCN2 mRNA在PSNL神经病理性疼痛模型后显著增加.

目的 通过检测风湿性心脏病(风心病)心房颤动(房颤)患者右心耳组织miR-1及其靶基因HCN4表达,探讨miR-1参与风心病房颤的可能机制.方法 36例风心病患者根据是否存在房颤,分为房颤组(AF组)和窦性心律组(SR组),术前均进行心脏彩超、心电图检测,术中取右心耳组织,应用荧光定量PCR技术检测miR-1及靶基因HCN4的表达,免疫组化、Western Blot方法检测HCN4蛋白表达,应用膜片钳技术检测右心耳心肌细胞起搏电流(If).结果 AF组miR-1基因表达小于SR组[(0.0050±0.0007)vs.(0.0094±0.0025),P<0.05];而HCN4基因表达水平AF组高于SR组[(0.2552±0.0194)vs.(0.1592±0.0131),P<0.05];免疫组化AF组HCN4蛋白表达较窦性心律组增强;Western Blot检测HCN4蛋白表达水平AF组高于SR组[(1.1702±0.05598)vs.(0.3606±0.01778),P<0.05];右心耳心肌细胞起搏电流改变,AF组半稳态激活电压(V1/2)为(-88±5.9)mV,稳态激活曲线斜率(K)为(8.2±1.8);SR组V1/2为(-97±4.5)mV,K为(11.4±2.6).结论 风心病房颤患者miR-1表达降低,调控HCN4基因、蛋白表达增高,导致房颤心肌细胞起搏电流的改变,可能参与风心病房颤的发生.

目的:探讨超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels,HCN通道)4种亚型在大鼠脊髓背角浅层的表达与分布特点.方法:选取3～5周龄SD大鼠,雌雄不拘,制作L4～L5段脊髓横切片,应用免疫组织化学技术及激光共聚焦成像技术,观察HCN通道的4种亚型在脊髓背角浅层神经元、胶质细胞及神经元亚细胞结构中的分布.结果:HCN通道不同亚型在正常SD大鼠脊髓背角中的表达和分布具有特异性:(1)HCN1主要与神经元标志物[神经元核抗原(neuronal nuclei,NeuN)]和星形胶质细胞标志物[胶质细胞原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)]共存,HCN2和HCN3主要与NeuN共定位;(2)HCN2主要与肽能初级传入神经末梢标志物[降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)]共存, HCN4主要与非肽能初级传入神经末梢标志物[异凝集素B4(isolectin B4,IB4)]共存;(3)HCN1和HCN4主要与神经元树突标志物[微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)]共存;(4)HCN4主要与抑制性中间神经元轴突末梢标志物[囊泡γ-氨基丁酸转运体(vesicular γ-aminobutyric acid transporter,VGAT)]共存.结论:HCN1～4主要分布在大鼠脊髓背角浅层,且在神经元、胶质细胞及神经元亚细胞结构中呈特异性分布.

伊伐布雷定通过选择性抑制超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN)介导的If电流,降低窦房结4期自动去极化速率而减慢心率.此外,伊伐布雷定还能通过降低心率来改善心肌能量供应,预防心脏重构并改善远期预后,目前在心力衰竭、冠心病心绞痛和不适当窦性心动过速三方面具有明确的治疗作用.本文仅就伊伐布雷定的电生理作用特点及其在临床应用中的重要研究进展作扼要介绍.

目的 分析心房肌超极化激活环核苷酸门控阳离子通道2(HCN2)及超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(HCN4)基因在心房颤动大鼠心肌中的表达,观察青山健心片对HCN2、HCN4 mRNA及蛋白表达的干预作用,揭示其治疗心房颤动的机制.方法 取阵发性心房颤动大鼠心房组织,采用蛋白免疫印迹法(Western-Blot)及荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测HCN2、HCN4的表达,分析青山健心片的干预作用.结果 阵发性心房颤动大鼠HCN2、HCN4 mRNA及蛋白表达量均高于对照组,青山健心片及美托洛尔均能降低HCN2、HCN4 mRNA及蛋白表达.结论 青山健心片通过下调HCN2、HCN4表达,影响超极化激活阳离子电流(If),从而减少心房颤动发作.

目的 探讨伊伐布雷定对心肌肥厚大鼠超极化激活环核苷酸门控非选择性阳离子通道(HCN)和交感神经的影响.方法 18只雄性SD大鼠分为假手术组(Sham组)、模型组和伊伐布雷定组(IVA组),每组6只.模型组和IVA组行腹主动脉缩窄术,术后12周IVA组予以10 mg·kg-1·d-1的伊伐布雷定灌胃,Sham组和模型组予以等体积生理盐水灌胃.17周后处死大鼠,测定全心质量指数、左心室质量指数,苏木素-伊红(HE)染色评估心肌肥厚水平,免疫组织化学检测心肌HCN和酪氨酸羟化酶(TH),Western blot和PCR检测HCN蛋白和mRNA水平,ELISA法检测心肌组织去甲肾上腺素(NA)和肾上腺素(EPI)水平.结果 与Sham组比较,模型组、IVA组全心质量指数、左心室质量指数增加,差异有统计学意义(P<0.05).Sham组心肌细胞规则紧密;模型组心肌细胞变长,细胞核体积增加,排列稀疏、不规则;IVA组心肌细胞排列基本整齐.Sham组心肌细胞少量表达HCN2、HCN4,模型组HCN2和HCN4表达水平较Sham组明显增加,IVA组较模型组减少(P<0.05).与Sham组比较,模型组TH分布及NA、EPI表达明显增加,而IVA组TH分布及NA、EPI较模型组表达减少(P<0.05).结论 伊伐布雷定能抑制心肌肥厚大鼠HCN及交感神经的表达.

目的 探讨超极化激活环核苷酸门控性阳离子通道蛋白(H C N)介导的Ih电流是否参与大鼠臂旁外侧核(LPBN)神经元温度敏感性的形成.方法 选取雄性SD大鼠为实验动物,采用实时定量聚合酶链式反应(real-time qPCR)检测6只大鼠HCN通道的主要亚型;采用免疫荧光检测其主要亚型在LPBN分布;采用全细胞脑片膜片钳电流钳技术鉴定大鼠L PBN神经元温度敏感性,然后在全细胞电压钳模式下进一步检测温度变化对不同类型LPBN神经元Ih电流的影响.结果 采用real-time qPCR技术在6只大鼠的LPBN均检测到HCN1、HCN2、HCN3和HCN4 mRNA表达,其中,HCN2 mRNA表达丰度最高,HCN4 mRNA表达丰度最低.免疫荧光染色结果显示,HCN2通道在中央亚核、背亚核和外亚核3个LPBN亚核均有表达.脑片膜片钳全细胞实验显示,当膜电位为-120 mV时,温度升高引起LPBN热敏神经元Ih电流幅度增加、激活时间常数缩短、激活速度加快(n=7,P<0.05),但温度对冷敏神经元(n=5)和温度不敏感神经元(n=17)的Ih电流幅度、激活时间常数与激活速度差异无统计学意义(P>0.05).LPBN热敏神经元Ih电流激活速率的Q10值明显高于温度不敏感神经元(P<0.05),其Ih电流激活时间常数和激活速率的Q10值与放电频率温敏系数分别呈负相关和正相关.结论 Ih电流的温度依赖性激活参与了LPBN热敏神经元的温敏形成.