目的 构建人源R-spondin 2(roof plate-specific spondin 2,RSPO2)的真核表达载体,表达、纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc,用3C蛋白酶切除Fc结构域后,检测RSPO2-Fu的生物学活性.方法 基于生物信息学方法分析人源RSPO2蛋白的理化性质和结构,筛选获得可在溶液中稳定存在的RSPO2截短蛋白RSPO2-Fu.将编码RSPO2-Fu蛋白的基因亚克隆至pCMV-Fc载体后,将质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc瞬时转染入HEK293F细胞中表达72 h,通过Protein A层析柱纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc,用3C蛋白酶切去Fc结构域,分子筛进一步提纯获得RSPO2-Fu蛋白.最后,通过M50 Super 8 × TOPFlash检测RSPO2-Fu蛋白的生物学活性.结果 生物信息学分析结果显示,RSPO2全长有243个氨基酸,相对分子质量为28 300,等电点为9.42,为亲水性不稳定蛋白,RSPO2-Fu截短蛋白在溶液中的稳定性得到了极大提高;重组表达质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc经菌落PCR及测序证明构建正确;获得了纯度达95％的RSPO2-Fu蛋白;生物学活性检测结果显示,RSPO2-Fu的EC5.值为1.5× 10-12 mol/L.结论 对RSPO2蛋白适当截短后,可获得稳定表达的RSPO2-Fu蛋白,其对Wnt信号通路有明显激活作用,为Wnt信号通路中RSPO2相关生物学研究提供了更好的参考.

目的 设计通用甲型流感病毒DNA疫苗,并检测其在小鼠体内的免疫效力.方法 合成含H1N1、H3N2、H9N2亚型甲型流感病毒M2(3M2e)胞外结构域的DNA序列,克隆至载体pVAX1中,构建真核表达质粒pVAX1-3M2e.将质粒pVAX1-3M2e分别与细胞穿透肽(cell penetrating peptides,CPPs)RVG9dR、Protamine、RVG9dR+Protamine 多肽复合物(质量分数1∶1)按不同质量分数混合(1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8),进行凝胶阻滞试验,以确定DNA与CPPs的正确结合;并通过细胞荧光试验在细胞水平(293T细胞)检测CPPs的递送效率.选择RVG9dR+Protamine递送质粒pVAX1-3M2e经肌内免疫雄性BALB/c小鼠(多肽复合物两种剂量:25 μg pVAX1-3M2e+500 μg多肽复合物、50 μg pVAX1-3M2e+1000 μg多肽复合物,每组8只小鼠),检测通用甲型流感病毒DNA疫苗对3种亚型流感病毒(H1N1、H3N2、H9N2)的交叉保护作用.结果 DNA与RVG9dR、Protamine、RVG9dR+Protamine的最佳结合比分别为1∶2、1∶2、1∶1;RVG9dR+Protamine在1:20的质量分数下对质粒pVAX1-3M2e具有超强的递送效率;50 μg pVAX1-3M2e+1 000 μg多肽复合物对3种亚型流感病毒攻毒组小鼠的保护率均为100％.结论 由RVG9dR+Prot-amine多肽复合物递送的质粒pVAX1-3M2e在小鼠中提供了针对3种亚型甲型流感病毒的交叉保护.

目的 通过噬菌体展示技术,从免疫骆驼的外周淋巴血液中获得与RSPO1结合的纳米抗体,纯化后构建RSPO1噬菌体展示文库,并进行免疫淘选.方法 将RSPO1基因与pCMV-Fc载体连接后,构建质粒RSPO1-pCMV-Fc,瞬时转染 HEK-293F 细胞,表达 RSPO1 蛋白;经 Protein A 凝胶柱、HiLoadTM 16/600 SuperdexTM 200pg 柱、Super-dexTM 24 Increase10/300GL柱依次纯化RSPO 1蛋白后,免疫骆驼,收集外周血并分离淋巴细胞;提取细胞RNA,反转录合成cDNA,通过2步巢式PCR扩增VHH片段,克隆至pMECS噬菌粒载体中,构建噬菌体展示文库,经2轮淘选使与RSPO1结合的噬菌体得到聚集后,进行ELISA鉴定并测序.结果 质粒RSPO1-pCMV-Fc经PCR及测序鉴定证明构建正确.表达的RSPO1蛋白相对分子质量约172 000,纯度约为70％;RSPO1噬菌体展示文库库容为1.2× 108cfu,经2轮淘选使噬菌体富集度达到12;共获得19个纳米抗体序列.结论 获得了多样性良好的纳米抗体序列,为了解与RSPO1相关的Wnt信号通路提供了可能.

目的:分析Rab32对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)细胞增殖、迁移及侵袭的影响及作用机制；方法:通过生物信息学判断NSCLC中Rab32的表达；用qRT-PCR和Western blot检测NSCLC细胞中Rab32 mRNA和蛋白表达水平；应用Rab32过表达慢病毒感染A549和H1299细胞，构建Rab32稳转A549和H1299细胞株为观察组，空载体慢病毒感染A549和H1299细胞后构建的为对照组；利用CCK-8和集落形成实验判断Rab32对NSCLC细胞影响增殖能力；通过划痕和Transwell实验检测Rab32对A549和H1299细胞迁移和侵袭能力的影响；利用Western blot检测不同组细胞中EMT标志物(E-cadherin、N-cadherin和Vimentin)蛋白的表达水平变化。结果:通过生物信息学分析显示，肺腺癌(Lung adenocarcinoma, LUAD)和肺鳞癌(lung squamous cell carcinoma, LUSC)中Rab32的mRNA表达较对照组显著降低(P<0.05)；qRT-PCR及Western blot结果表明A549、H1299和HCC827中Rab32 mRNA和蛋白表达水平显著低于正常人支气管上皮细胞Beas-2B，其中A549和H1299细胞中Rab32 mRNA和蛋白较Beas-2B下降显著。A549、H1299细胞中，观察组的Rab32 mRNA和蛋白表达水平显著高于空载体对照组(P<0.05)。CCK-8和集落形成实验结果表明观察组的细胞增殖和克隆能力较对照组显著下降(P<0.05)；划痕和Transwell实验结果提示观察组细胞的迁移和侵袭能力明显下降(P<0.05)；Western blot结果显示观察组细胞的上皮表型标志物E-cadherin蛋白表达水平显著高于对照组，而间皮表型标志物N-cadherin和Vimentin表达较对照组明显升高(P<0.05)。结论:Rab32抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭，可作为潜在临床治疗NSCLC患者新途径。

目的 探讨肌动蛋白相关蛋白2(ARPC2)通过人抗原R(HuR)对肺癌细胞放疗抵抗的影响.方法 将肺癌细胞根据不同处理,分为7组,ARPC2过表达组(使用ARPC2过表达慢病毒感染肺癌细胞)、ARPC2敲低组(使用shARPC2敲低慢病毒感染肺癌细胞)、HuR过表达组(使用HuR过表达慢病毒感染肺癌细胞)、HuR敲低组(使用shHuR敲低慢病毒感染肺癌细胞)、ARPC2过表达的同时HuR敲低组(同时使用ARPC2过表达和shHuR敲低慢病毒感染肺癌细胞)、ARPC2敲低的同时HuR过表达组(同时使用shHuR敲低和HuR过表达慢病毒感染肺癌细胞)、对照组(使用空载体慢病毒感染肺癌细胞).6 Gy的电离辐射处理后,流式细胞术检测各组肺癌细胞(A549、Calu-1、HCC827、MSTO-211H、NCI-H1299、NCI-H520、SK-MES-1)的凋亡水平.免疫印迹法检测肺癌细胞中HuR的蛋白表达水平.通过凋亡水平指示肺癌细胞的放疗抵抗.通过HuR的表达水平的半衰期以指示HuR的稳定性.比较用非配对双尾t检验,多组间比较则采用方差分析.结果 A549(0.43±0.08、1.88±0.15)、Calu-1(0.38±0.05、1.90±0.14)、HCC827(0.37±0.07、1.89±0.23)、MSTO-211H(0.39±0.06、1.95±0.29)、NCI-H1299(0.40±0.07、1.92±0.32)、NCI-H520(0.42±0.10、1.85±0.30)、SK-MES-1(0.44±0.09、1.90±0.33)中 ARPC2 的 mRNA 和蛋白表达水平高于人正常肺细胞 BEAS-2(0.12±0.03、1.19±0.19)、BNHLF(0.08±0.02、1.16±0.20,t=11.473、14.100、13.825、15.627、18.364、20.594、24.504、9.107、10.335、9.634、11.910、10.882、9.027、10.658,P＜0.05).电离辐射处理组中 ARPC2 的蛋白表达水平(0.81±0.15、1.25±0.25、0.63±0.12,0.51±0.10、0.64±0.15、1.86±0.30、0.85±0.14)高于未处理组(0.17±0.04、0.15±0.04、0.16±0.04,0.17±0.05、0.16±0.04、0.17±0.05、0.18±0.06,t=13.037、21.035、13.610、7.331、9.925、28.567、14.814,P＜0.05).电离辐射处理后ARPC2过表达组肺癌细胞的凋亡[(16.48±6.11)％、(16.03±5.35)％、(18.28±8.22)％、(24.70±9.71)％、(17.68±9.11％)]低于对照组[(47.92±6.58)％、(55.31±6.94)％、(51.29±7.16)％、(51.96±9.17)％、(54.16±2.24)％,t=11.071、14.183、9.579、6.453、12.311,P＜0.05],ARPC2 敲低组肺癌细胞的凋亡[(70.47±8.46)％、(84.16±0.73)％、(76.71±1.87)％、(76.05±0.47)％、(88.07±9.14)％]高于对照组[(55.21±6.29)％、(51.59±7.04)％、(50.07±5.33)％、(47.14±7.53)％、(44.41±9.38)％,t=4.584、14.550、14.912、12.124、10.543,P＜0.05].ARPC2 过表达组中 HuR、p-HuR、JAK1、p-STAT3 的蛋白表达水平(0.81±0.11、0.92±0.14、0.55±0.10、0.63±0.12)高于对照组(0.15±0.03、0.14±0.04、0.15±0.03、0.16±0.05,t=18.305、22.614、8.391、11.287,P＜0.05),ARPC2 敲低组中 HuR、p-HuR、JAK1、p-STAT3 的蛋白表达水平(0.19±0.05、0.15±0.04、0.14±0.03、0.17±0.05)低于对照组(0.90±0.15、0.85±0.13、0.63±0.12、0.71±0.14,t=14.200、15.628、11.307、13.462,P＜0.05).ARPC2 过表达组[(11.32±0.26)、(10.17±0.22)、(10.49±0.21)、(10.17±0.03)、(10.53±0.06)h]相较对照组 HuR 半衰期[(5.61±1.31)、(5.30±2.53)、(5.72±1.95)、(5.34±0.70)、(5.86±1.09)h]延长(t=13.523、6.056、7.691、21.819、13.533,P＜0.05),ARPC2 敲低组[(2.02±0.71)、(2.96±1.23)、(2.61±0.68)、(3.04±0.82)、(2.23±0.22)h]相较于对照组 HuR 半衰期[(4.92±1.69)、(5.05±0.45)、(5.38±0.56)、(5.64±0.21)、(4.62±0.37)h]缩短(t=5.012、5.047、9.941、9.714、17.558,P＜0.05).电离辐射处理后,HuR 过表达组(23.01±3.83、17.30±6.59、21.10±4.58、16.44±9.04、23.36±4.56)比对照组(47.30±6.59、51.10±4.58、46.44±9.00、53.36±9.56、45.97±2.54)可抑制肺癌细胞的凋亡(t=10.077、13.322、7.935、8.869、13.716,P＜0.05),HuR 敲低组(80.90±17.46、72.24±10.84、77.82±18.9、84.16±10.98、83.50±11.54)比对照组能促进肺癌细胞的凋亡(t=5.693、4.918、5.163、6.025、5.925,P＜0.05).结论 ARPC2通过提高HuR的蛋白稳定性促进了肺癌细胞的放疗抵抗.

目的 探讨姜黄素对高糖环境下人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化的影响及其机制.方法 将培养的hBMSCs分为正常组、高糖组和高糖+姜黄素组.通过检测碱性磷酸酶(ALP)活性评估各组细胞早期成骨分化水平;茜素红染色评估成骨分化晚期矿化结节的形成情况;RT-PCR检测成骨诱导分化21 d后成骨相关基因Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OCN)和Ⅰ型胶原蛋白(COL-1)的表达;采用Western blot检测各组细胞中血红素氧合酶-1(HO-1)的表达;进一步构建HO-1小干扰RNA(siRNA)模型并检测干扰效率,对比高糖+姜黄素组和高糖+姜黄素+siHO-1组成骨相关蛋白(Runx2、OCN和COL-1)的表达水平.结果 与正常组比较,高糖组细胞ALP活性降低,矿化结节形成减少,成骨相关基因(Runx2、OCN、COL-1)表达下降,HO-1的表达受到抑制(P＜0.05);与空载体组相比,siHO-1组HO-1表达显著下降,表明siRNA干扰成功(P＜0.01).相比高糖+姜黄素组,高糖+姜黄素+siHO-1组成骨相关蛋白(OCN、COL-1和Runx2)的表达水平均下降(P＜0.05).结论 姜黄素可改善高糖环境下hBMSCs的成骨分化能力,且与HO-1的表达有关.

目的:桃红四物汤调控核因子E2相关因子(Nrf2)/Kelch样ECH关联蛋白1(Keap1)/血红素氧合酶-1(HO-1)信号通路介导的铁死亡在膝骨关节炎(KOA)中的作用机制.方法:40只SD大鼠随机分为假手术对照组、模型对照组、桃红四物汤9 g/kg组、双醋瑞因胶囊0.0045 g/kg组,每组各10只;各组均采用内侧半月板失稳手术造模,造模成功1 w后各组灌胃给予相应的药物或无菌水,1次/d,连续8 w.干预完成后,检测各组大鼠血清白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-18含量及关节软骨组织丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、活性氧(ROS)含量;透射电镜观察大鼠软骨线粒体数量、形态、结构及分布情况;Western Blot法检测大鼠关节软骨组织Keap1、Nrf2、HO-1、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、肿瘤抑制蛋白53(P53)、溶质载体家族7成员11重组蛋白(SLC7A11)的表达.结果:与假手术对照组比较,模型对照组Mankin和OARSI病理评分增加,IL-1β、TNF-α、IL-18、MDA、ROS含量显著升高,Keap1、P53蛋白表达显著上调,SOD活力显著降低,Nrf2、HO-1、GPX4、SLC7A11蛋白表达显著下调(P＜0.01);与模型对照组比较,桃红四物汤组Mankin和OARSI病理评分降低,IL-1β、TNF-α、IL-18、MDA、ROS含量降低,Keap1、P53蛋白表达显著下调,SOD活力显著升高,Nrf2、HO-1、GPX4、SLC7A11蛋白表达显著上调(P＜0.01).结论:桃红四物汤可能通过激活Nrf2/Keap1/HO-1信号通路抑制大鼠关节软骨铁死亡.

目的:本研究旨在制备生物合成纳米载体递送柚皮素(naringenin,Ng),并研究其对乳腺癌的体外抑瘤效果.方法:使用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-前列腺素F2受体阴性调节因子-绿色荧光蛋白(Arg-Gly-Asp-prostaglandin F2 receptor negative regulator-green fluorescent protein,RGD-P-G)质粒进行转染,构建分泌 RGD-P-G 外泌体(RGD-P-G-Exosomes,RGD-P-G-Exo)的293F细胞.通过超速离心收集293F细胞上清液中的RGD-P-G-Exo,加入Ng,并通过水浴超声促使RGD-P-G-Exo包封Ng,形成RGD-P-G-Exo@Ng.使用荧光显微镜对转染RGD-P-G的293F细胞进行鉴定.通过透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析技术、蛋白质免疫印迹等方法对RGD-P-G-Exo@Ng的形貌、粒径、标志物和绿色荧光蛋白(GFP)表达情况进行表征.采用紫外分光光度法评估包封率和载药量.通过细胞摄取实验评估纳米药物被吞噬摄取的效果.通过CCK-8法检测Exo@Ng和RGD-P-G-Exo@Ng对乳腺癌MDA-MB-231细胞的杀伤能力.结果:电镜结果显示RGD-P-G-Exo@Ng呈茶托状结构,纳米颗粒追踪分析技术显示RGD-P-G-Exo@Ng粒径主要分布在147.0 nm.蛋白免疫印迹结果表明RGD-P-G-Exo@Ng表达CD9、CD63等外泌体标志物和GFP,证明RGD-P-G-Exo的构建成功.RGD-P-G-Exo@Ng纳米药物的包封率为(28.1±0.6)％,载药量为(6.0±0.1)％.在高浓度下,Exo及RGD-P-G-Exo对MDA-MB-231细胞的存活率无显著影响,具有良好的生物相容性.在细胞摄取实验中,与Exo@Ng相比,RGD-P-G-Exo@Ng具有更强的细胞摄取效果(P＜0.05).药效实验中,Exo@Ng和RGD-P-G-Exo@Ng均表现出浓度依赖性的MDA-MB-231细胞毒性,其中RGD-P-G-Exo@Ng比相同浓度的Exo@Ng具有更强的细胞杀伤能力(P＜0.05).结论:本研究初步合成了一种用于靶向递送Ng的纳米药物,为开发生物纳米靶向肿瘤药物递送系统提供了新的策略.

目的 探究环磷酸腺苷(cAMP)信号通路在生长抑素受体5(SSTR5)激活对垂体催乳素腺瘤激素分泌抑制作用中的调控机制.方法 使用构建的SSTR5过表达GH3细胞系作为垂体催乳素腺瘤的体外细胞模型,采用不同浓度SSTR5激动剂BIM23052联合cAMP激动剂Forskolin(5 μmol/L)或百日咳毒素(10 nmol/L)进行细胞刺激,或联合转染过表达环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)作为干预.通过荧光素酶报告基因系统检测不同刺激组间PRL-luc、环磷酸腺苷反应元件(CRE)-Luc、Pit1-Luc、AP1-Luc和雌激素反应元件(ERE)-Luc启动子活性,Renilla荧光素酶基因用作内参以标准化转染效率.组间统计分析采用Student's t检验和单向方差分析.结果 为验证GH3细胞中SSTR5过表达的有效性,使用cAMP响应元件报告载体进行监测,GH3SSTR5细胞中CRE 报告基因活性显著低于 GH3mock 组[(74.87±6.66)％比(100.00±5.21)％,t=5.15,P＜0.05],提示SSTR5过表达显著抑制CRE转录活性.不同浓度BIM23052(0、0.1、1.0、10.0、100.0nmol/L)联合Forskolin(5 μmol/L)预处理GH3SSTR5细胞,CRE报告基因活性分别为(100.00±2.23)％、(17.79±2.30)％、(6.25±0.37)％、(25.27±2.99)％、(44.60±3.25)％,提示BIM23052降低了 Forskolin诱导的CRE转录活性,呈现U型剂量响应曲线,在1.0 nmol/L时抑制效果最强(t=71.68,P＜0.01).此外,Pit1启动子包含CRE元件,与未添加BIM23052和Forskolin组[CRE 报告基因活性(100.00±4.24)％]比较,不同浓度 BIM23052(0、0.1、1.0、10.0、100.0 nmol/L)联合Forskolin(5 μmol/L)预处理GH3SSTR5细胞,Pit1报告基因活性分别为(317.91±9.03)％、(278.11±4.94)％、(250.72±14.33)％、(176.21±8.88)％、(162.34±7.54)％,表明 BIM23052 处理同样降低了 GH3SSTR5细胞中Forskolin诱导的Pit1启动子活性,且这种降低具有剂量依赖性(P＜0.01).然而,BIM23052和百日咳毒素处理对Prl启动子上的其他响应元件,如AP1或ERE(雌激素反应元件),并未表现出明显抑制作用(P＞0.05).过表达CREB后,Prl启动子活性从空白转染组[Ctrl 组(100.00±12.01)％比 BIM 组(63.02±15.35)％,t=5.10,P＜0.01]到 CREB 过表达组[Ctrl组(102.17±11.80)％比 BIM 组(106.27±14.62)％,t=0.58,P＞0.05].结论 在垂体催乳素腺瘤中,SSTR5通过抑制cAMP-CREB途径来调控催乳素合成.

目的 探讨可溶性生长刺激表达基因 2 蛋白(sST2)对缺血性心肌病(ICM)大鼠心室重塑的调控作用.方法 采用左侧冠状动脉结扎法建立ICM大鼠模型,随机分为模型组(15 只)、空载体组(15 只)及用药组(15 只),另设假手术组(15 只);空载体组皮下注射 1 mL空载腺病毒,用药组皮下注射1mL腺病毒sST2载体诱导sST2过表达,模型组及假手术组皮下注射等量生理盐水,所有大鼠连续给药 2 d后正常饲养 1 周.所有大鼠均在末次给药后 1 周通过超声心动图检查心室重塑指标[左心室射血分数(LVEF)、左心室舒张末期内径(LVEDd)、左心室收缩末期内径(LVESd)、室间隔舒张末期厚度(IVSd)],并检测血清sST2、心肌损伤标志物[心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)]及炎症指标[白细胞介素(IL)-33、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]水平,同时通过苏木精-伊红(HE)染色实验与Masson染色实验观察大鼠心肌组织病理变化及心肌纤维化程度,并通过免疫组化实验检测心肌组织中sST2表达情况.sST2 表达水平与炎症指标及心室重塑指标的相关性应用Pearson相关性分析.结果 与假手术组相比,模型组及空载体组大鼠心肌细胞排列紊乱,细胞间隙较大,心肌细胞间质胶原沉积较为明显,用药组大鼠心肌细胞排列更加不规则,细胞间隙更大,间质胶原沉积更多.模型组、空载体组及用药组LVEF、IL-33 低于假手术组,且用药组上述指标低于模型组与空载体组(F=618.974、28.151,P<0.05);模型组、空载体组及用药组LVEDd、LVESd、IVSd、sST2、cTnI、CK、CK-MB、IL-6、TNF-α水平高于假手术组,且用药组上述指标高于模型组与空载体组(F=3.665、3.418、122.807、36.596、101.736、37.573、79.716、20.371、51.494,P<0.05);模型组、空载体组及用药组心肌组织中sST2表达水平高于假手术组,且用药组高于模型组与空载体组(F=122.843,P<0.05);ICM大鼠血清及心肌组织中sST2 水平与心室重塑指标LVEF及炎症指标IL-33呈负相关(P<0.05),与LVEDd、LVESd、IVSd、IL-6、TNF-α呈正相关(P<0.05).结论 sST2与ICM大鼠心室重塑有关,sST2高表达会促进大鼠心室重塑进程.