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胎肝及骨髓来源造血干/祖细胞电离辐射敏感性的比较研究
编辑人员丨1周前
目的:研究电离辐射对胎肝与骨髓来源造血干/祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cells,HSPCs)的影响差异。方法:取14.5 d小鼠胎肝及8周龄小鼠骨髓,分选c-Kit +细胞体外接受 60Co单次5、10 Gy照射,检测HSPCs中细胞凋亡、线粒体活性氧(ROS)水平、集落形成能力、DNA损伤情况。将12只CD45.1背景的C57BL/6J小鼠按随机数表法分成骨髓组(BM)和胎肝组(FL), 60Co全身照射,第1次4.5 Gy照射,间隔30 min后再进行第2次5 Gy剂量照射,6 h后进行移植,12周后检测嵌合率、谱系分化以及细胞周期。分选胎肝及骨髓的c-Kit +细胞检测线粒体压力。 结果:与骨髓HSPCs相比,照射后胎肝HSPCs的细胞凋亡比例显著升高( t=16.21、12.27, P<0.05),ROS水平显著增加( t=68.72、18.89, P<0.05);集落形成能力显著降低,在5 Gy时胎肝HSPCs成集落能力显著降低,照射剂量为10 Gy时完全不能形成集落( t=12.41、15.67、9.46, P<0.05);γ-H2AX免疫荧光染色结果显示,照射后胎肝HSPCs的DNA损伤更加严重,形成的Foci数量显著升高( t=2.27、2.03, P<0.05)。这些结果表明,胎肝HSPCs对辐射更加敏感。移植结果显示,移植胎肝HSPCs的嵌合率低于骨髓细胞( t=5.84, P<0.05);在移植嵌合小鼠的骨髓与脾脏中,胎肝细胞组髓系细胞的比例高于骨髓细胞组,提示胎肝HSPCs体内重建能力低于骨髓HSPCs,并且更容易向髓系分化。细胞周期检测结果显示胎肝组S期比例显著高于骨髓组( t=2.89, P<0.05)。线粒体压力结果显示胎肝HSPCs基础呼吸能力( t=39.19, P<0.05)、质子泄漏( t=6.64, P<0.05)、三磷酸腺苷(ATP)产生( t=9.33, P<0.05)、耦联效率( t=7.10, P<0.05)均高于骨髓c-Kit +细胞;呼吸储备能力( t=5.53, P<0.05)低于骨髓细胞。 结论:利用多种方法对照射后胎肝及骨髓来源的HSPCs进行检测,明确了电离辐射对两种不同HSPCs功能的影响,为深入探索放射对不同发育阶段造血干细胞的影响奠定基础。
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编辑人员丨1周前
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Marcksl1基因敲除对小鼠成年造血的影响
编辑人员丨2023/8/12
目的 建立造血系统特异性Marcksl1 敲除小鼠,探究该基因敲除对小鼠成年造血的影响.方法 对E15.5 Marcskl1 敲除小鼠进行胎肝竞争性移植实验,分析胎肝移植后不同月龄小鼠外周血中成熟功能谱系血细胞的占比.流式分选胎肝KSL细胞,利用RNA-Seq分析该基因敲除后差异基因表达.利用CRISPR/Cas9 技术,构建Marcksl1 条件敲除小鼠,并与Vav1-Cre小鼠杂交,获得造血系统特异性Marcksl1 敲除小鼠.利用PCR和Sanger测序鉴定基因型.利用Real-time PCR检测小鼠骨髓和造血干细胞中Marcksl1 mRNA的表达.利用流式细胞技术分析小鼠骨髓、外周血、脾和胸腺中不同类型造血细胞的占比.通过竞争性骨髓移植实验分析Marcksl1 敲除对造血重建的影响.结果 Marcksl1 敲除造成胎肝移植后B细胞占比下降、髓系细胞占比升高,骨髓中CLP和CMP占比下降、GMP占比升高.RNA-seq结果显示该基因敲除后导致胎肝KSL细胞中 252 个基因上调,400 个基因下调.GO结果显示差异基因主要富集在免疫应答、质膜以及低压门钙离子通道活性等相关基因.KEGG结果显示差异基因主要富集在造血谱系分化和细胞因子受体互作相关信号通路.我们利用CRISPR/Cas9 技术成功建立造血特异性Marcksl1 敲除小鼠.流式结果表明Marcksl1 缺失不影响小鼠成年造血,但影响骨髓移植后的造血重建能力.结论 成功建立造血系统特异性Marcksl1 敲除小鼠.造血系统敲除Marcksl1 基因,不影响成年稳态造血,但影响成年造血重建能力.我们建立的Marcksl1 条件敲除小鼠,为该基因的成年造血功能研究以及该基因的其他组织特异性功能研究提供了动物模型.
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编辑人员丨2023/8/12
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Notch信号途径对放疗后骨髓谱系造血重建的影响及其机制
编辑人员丨2023/8/6
目的 探讨Notch信号途径对放疗后骨髓谱系造血重建的影响及其机制.方法 通过交配获得骨髓造血细胞特异性敲除Notch信号MxCre+ RBP-Jflox/flox的双转基因小鼠(敲除组)和未敲除MxCre+ RBP-Jflox/+对照小鼠(未敲除组),给予全身一次性60Co-γ射线电离辐照,观察辐照后第7天两组生存状态、造血重建情况.C57/B6小鼠接受全身一次性60Co-γ射线电离辐照,通过腹腔注射Notch配体重组蛋白D1R或PBS分别建立Notch信号激活小鼠(激活组)和未激活小鼠(未激活组),观察给药第7天重组蛋白D1R的体内活性、两组造血重建情况以及髓系前体细胞周期、增殖信号通路变化.另取C57/B6小鼠随机分为阴性对照组、D1R组、阳性对照组,D1R组和阳性对照组同时接受等剂量60Co-γ射线电离辐照后腹腔注射D1R和PBS,阴性对照组不予处理,停药3个月,观察重组蛋白D1R长期毒性.结果 与未敲除组比较,敲除组生存状态更差,骨髓造血干/祖细胞、骨髓和外周血有核细胞及髓系细胞形态正常,但数量明显减少(P均<0.05).与未激活组比较,激活组骨髓造血细胞Notch信号活化片段ICN1的核表达增多,Notch信号激活,骨髓造血干/祖细胞、骨髓和外周血有核细胞及髓系细胞数均明显高于对照组(P均<0.05),骨髓髓系前体细胞G0/G1期比例减少,S期比例增多,PI3K蛋白表达增加(P均<0.01).停药3个月,D1R组细胞形态、组织构架及造血谱系与阴性对照组无明显差别,但骨髓造血干/祖细胞、骨髓和外周血髓系细胞数明显高于阳性对照组(P均<0.05).结论 Notch信号途径可正向调控放疗后造血重建,尤其髓系重塑,其机制可能与Notch信号激活髓系前体细胞PI3K增殖信号通路、加快细胞周期进程有关.
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编辑人员丨2023/8/6
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破而后立:骨骼系统中破骨细胞新功能解析
编辑人员丨2023/8/5
骨骼系统为支撑身体、协调躯体运动、控制矿物质稳态和造血提供了重要的基础.破骨细胞是由单核/巨噬细胞造血谱系前体细胞融合而成的特化细胞,在骨稳态和健康维持中至关重要.已有大量实验证实其细胞形成和功能失调与骨质疏松症、骨折愈合、骨关节炎和原发性/转移性骨肿瘤等密切相关.一直以来,破骨细胞作为"噬骨者(bone eaters)"被聚焦于探讨其在骨稳态和疾病中的角色.近年来,随着单细胞标记和检测技术的快速发展并在骨领域中的广泛应用,新的"破骨细胞亚型"概念及其功能不断得到解析和完善.骨微环境稳态是破骨细胞及其主导的细胞网络共同活动的结果;从细胞网络出发,系统阐释破骨细胞与骨/关节疾病的内在关系,才能更好地理解疾病的本质."破而后立"——是本课题组所提出通过调控破骨细胞来重建骨微环境稳态、以延缓骨/关节疾病进程的新理念.同时,将"破骨细胞"概念引入传统组织工程骨与软骨构筑技术,有望实现骨/软骨疾病干预和再生修复的综合应用.
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编辑人员丨2023/8/5
