为了对来自酵母细胞的天然转化酶分子进行改造,以使其适用于工业和医药领域,利用壳寡糖(COS)对酵母转化酶(YInv)的氨基进行修饰.结果发现:COS修饰后的糖链成功连接到转化酶肽链的氨基上,修饰酶(COS-Inv)的分子量比天然酶(YInv)的明显增大;COS-Inv的催化活性比YInv的提高200.3％.YInv和COS-Inv分子中的多糖含量分别为 2.75 和 6.34 mg/mg.COS-Inv 的Km值(58.92 mmol/L)比 YInv 的Km值(125.45 mmol/L)低得多.YInv和COS-Inv的三维荧光光谱测定结果表明,COS-Inv的荧光强度比YInv的荧光强度低得多,说明COS-Inv与YInv两者的三维分子结构有非常大的差别.由此可见,利用壳寡糖修饰酵母转化酶以改造其分子结构是提高其催化活性的有效办法.

目前,绝大多数酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株利用菊糖生产乙醇的能力有限,而蔗糖转化酶Suc2 是酿酒酵母水解菊糖的关键酶,其分泌水平直接影响酿酒酵母转化菊糖为乙醇的性能.为提高酿酒酵母中蔗糖转化酶Suc2 的分泌表达水平,利用生物信息学的分析方法选择出 11 种不同的分泌信号肽,包括酿酒酵母内源性、其他菌株来源以及已报道序列优化改造的信号肽,将它们融合至Suc2 并构建了相应的酿酒酵母BY4741 重组菌.其中,酿酒酵母内源分泌信号肽AGA2 能使蔗糖转化酶Suc2 更有效的分泌,含有信号肽AGA2 的重组菌BY-AG的蔗糖酶酶活和菊糖酶酶活相对于含有天然信号肽的原始菌BY-S分别提高 42%和26%,其利用菊糖产乙醇能力较原始菌提高了32%,乙醇产量达到78.11 g/L.在使用毕赤酵母(Pichia pasto-ris)分泌信号肽MSB2 时,蔗糖转化酶Suc2 的分泌水平也有提高,含有信号肽MSB2 的重组菌BY-MS较原始菌BY-S的蔗糖酶酶活和菊糖酶酶活分别提高了80%和74%,同时,利用菊糖产乙醇能力也提高了56%,产量达到86.31 g/L.最后,对重组菌BY-MS摇瓶发酵过程中的生物量、蔗糖酶酶活、残糖总量和乙醇产量进行了监测,结果表明,重组菌BY-MS的发酵性能较原始菌BY-S有显著提高.本研究为提高蔗糖转化酶Suc2 的分泌水平、构建高效菊糖基乙醇生产菌株提供参考.

目的 观察硒和叶酸对冠心病射血分数降低心力衰竭(HFrEF)伴高同型半胱氨酸血症病人B型利钠肽(BNP)、同型半胱氨酸(Hcy)、心功能的影响.方法 选取2017年1月—2018年1月在安康市中心医院住院的冠心病HFrEF伴高同型半胱氨酸病人160例,使用双盲法将160例病人随机分为对照组、硒剂组、叶酸组、硒剂+叶酸组,每组40例.对照组接受血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)、β受体阻滞剂、利尿剂等常规抗心力衰竭治疗;硒剂组在常规抗心力衰竭治疗的基础上加用硒酵母片,每次100μg,每日2次;叶酸组在常规抗心力衰竭治疗的基础上加用叶酸片5 mg,每日1次;硒剂+叶酸组在常规抗心力衰竭治疗的基础上加用硒酵母片100μg,每日2次,叶酸片每次5 mg,每日1次.以治疗前、治疗1个月和6个月为观察时间点,检测各组Hcy、BNP水平,行心脏彩超检查并进行6 min步行试验(6MWT).结果 治疗1个月、6个月,硒剂+叶酸组BNP、Hcy水平均较治疗前下降,且硒剂+叶酸组BNP、Hcy水平低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05).治疗6个月时,4组病人LVEDD均较治疗前缩小,硒剂+叶酸组低于对照组,4组病人LVEF均较治疗前提高,硒剂+叶酸组高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);治疗1个月、6个月时,4组病人6MWT均较治疗前增加,治疗6个月时硒剂+叶酸组6MWT高于对照组(P<0.05).结论 联合应用硒剂和叶酸治疗冠心病HFrEF伴高同型半胱氨酸病人,可降低病人的BNP及Hcy水平,进一步改善病人心功能.

肿瘤抑制蛋白p53作为一种重要的转录因子,参与细胞周期调节、细胞凋亡、细胞衰老以及DNA修复等生物学过程.p53在不同生理条件下发挥相应的功能离不开众多辅因子的协助,这些辅因子可以调节p53的修饰状态、细胞亚定位,以及p53的稳定性等.因此,鉴定p53结合蛋白质对进一步理解p53在体内的信号调控网络具有重要生物学意义.本文利用酵母双杂交实验技术筛选出1个新的p53结合蛋白质,FADD样白细胞介素1β转化酶相关巨蛋白(FADD-like interleu-kin-1β-converting enzyme associated huge protein,FLASH).免疫共沉淀分析证实了FLASH与p53之间存在相互作用,并进一步阐明了这两个蛋白质之间相互作用的结构域基础.p53可同时与FLASH-N1(aa1 ～200)和FLASH-C1(aa1534 ～ 1780)相互作用.此外,FLASH-N、FLASH-C都能与p53-C(aa293～393)相互作用.通过报告基因研究FLASH对p53转录活性的影响,结果表明,FLASH全长以及FLASH-M(aa921 ～ 1533)能够增强p53的转录活性.综上所述,FLASH能够结合p53并增强其转录活性.

G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCR)配体的检测筛选是药物临床等研究的热点.研究探索何种条件下提高β型肾上腺素受体(β2?adrenergic receptor,β2AR)在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中传递信号的灵敏度以及反应时间,可以为配体等筛选研究(检测)奠定基础.首先,使用酿酒酵母α因子prepro序列、pre序列、酵母内源GPCR Ste2 N端、转化酶Suc2 N端作为信号序列分别与β2AR融合表达,通过荧光显微镜观察其在酵母中的定位.其次,构建敲除内源GPCR交配通路相关基因的菌株,替换内源G蛋白α亚基为哺乳动物G蛋白α亚基或者α亚基嵌合体Gpa1?Gαs?transplant,之后转入pFUS1?GFP或者pFUS1?Rluc报告基因系统.最后,使用异丙肾上腺素作为配体观察并比较激活后的输出信号.本研究成功构建出了能检测到交配通路信号的酵母菌株,并且发现使用信号序列将异源β2型肾上腺素受体定位到细胞膜上对于信号的输出强度有着促进的作用.与此同时,本实验还发现12 h配体孵育时间以及100μmol/L配体浓度是检测本通路信号的最佳条件.该研究对于未来探索更多的异源GPCR在酵母中成功表达和激活信号通路具有重要意义.

目的:设计并构建新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)在毕赤酵母表面的展示体系,并对表面展示的RBD进行功能性评价,从而为以RBD为靶点的高通量药物筛选平台奠定基础.方法:将四种锚定分子与新冠病毒RBD融合,电转化至毕赤酵母中;通过细胞免疫荧光分析,筛选能够成功展示RBD的锚定系统;进一步分析其与血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)受体的亲和力,证明展示在细胞表面RBD分子的功能.结果:仅Sed1p锚定分子能够有效呈递RBD至毕赤酵母细胞表面,展示效率约为70％;亲和力分析结果表明,ACE2受体和表面展示RBD的亲和力(KD=30.42 nmol/L)与溶液中RBD的亲和力(KD=16.00 nmol/L)较为接近.结论:这一体系能够在毕赤酵母表面高效地展示具有生物学功能的RBD,可用于抗新冠病毒RBD药物的高通量筛选和评价.