壳寡糖(COS)作为天然多糖壳聚糖(CS)的降解产物,既保留了 CS的良好生物相容性、无毒和可生物降解等特点,同时由于糖链缩短使相对分子质量降低,其水溶性和生物活性均得到提高且更容易被生物体吸收利用,近年来受到越来越多的关注.目前国内外学者对CS生物学功能的研究及其在生物医学领域中应用的报道较多,但对COS功能及其应用的研究报道较少.现结合国内外最新研究成果,对COS的主要生物学功能(抗炎、抗肿瘤、抗菌和促组织再生等)及其可能的作用机制进行总结和分析,并阐述其在生物医学领域中应用的研究进展,以期为COS的深入研究及其在生物医学领域中更广泛的应用提供理论依据和参考.

目的 从蛋白糖基化修饰角度探讨壳寡糖(COS)减弱动脉粥样硬化(AS)斑块形成的机制.方法 将 40 只ApoE-/-小鼠随机分为对照组和COS组.对照组饲给予高脂饲料 12 周,COS组给予高脂饲料+COS(每天灌胃,500 mg/kg)12 周.全自动生化分析仪检测两组小鼠的血脂水平并对主动脉斑块切片进行HE和油红O染色.凝集素芯片、液相色谱-串联质谱、酶联免疫吸附试验检测血清中糖蛋白变化.胆固醇酯流出实验和游离胆固醇酯测定实验评价清道夫受体B类成员 1(SRBI)糖基化修饰位点改变对巨噬细胞胆固醇流出量的影响.结果 COS显著降低小鼠TC和LDL-C水平(P＜0.05),但对TG、HDL-C、ApoA1 和ApoB100 无影响.与对照组相比,COS组主动脉内膜厚度和斑块大小明显变薄、变小(P＜0.05).两组小鼠血清中变化最明显的小扁豆凝集素(LCA)结合蛋白分子量为 80～90 ku,清道夫受体B类成员 1 为其中之一.COS促进了细胞内胆固醇的流出,抑制了游离胆固醇酯的积累(P＜0.05).SRBI敲低或N108 糖基化位点突变可抑制COS引起的胆固醇流出,增加细胞内游离胆固醇的积累(P＜0.05).结论 COS通过增加SRBI糖基化水平促进脂质外排,从而减少动脉粥样硬化的形成.

病原菌形成的生物被膜严重威胁人类健康,显著增强了病原菌的耐药性,针对生物被膜的特效药物亟待研究.从虾、蟹壳等中提取得到的壳寡糖是一种天然碱性寡糖,具有良好的杀菌效果,但其对生物被膜的抑制作用仍有待提高.螺旋藻(Spirulina,SP)是一种表面带负电荷的微藻,其与壳寡糖形成的复合物可能发挥协同增效杀灭生物被膜深处病原菌的作用.针对提升壳寡糖的抑生物被膜作用,本研究首先通过浊度法筛选得到了杀菌效果显著的壳寡糖,并通过静电吸附作用将壳寡糖与螺旋藻结合,完成螺旋藻@壳寡糖(Spriulina@Chitooligosaccharides,SP@COS)复合物的制备.通过测定 zeta电位、粒径和荧光标记等方法表征了壳寡糖和螺旋藻的结合情况,紫外-可见吸收光谱(ultraviolet-visible absorbance spectroscopy,UV-Vis)结果显示出螺旋藻对壳寡糖的包封率达 90%,负载率达16%.制备的SP@COS对细菌、真菌生物被膜都有明显的增效抑制作用,且这种抑制效果主要是通过深入生物被膜内部、破坏细胞结构所实现.这些结果显示了螺旋藻-壳寡糖复合物具备作为生物被膜抑制剂的潜力,为提高壳寡糖的抑生物被膜作用、解决病原菌的危害提供了理论基础与新的思路.

为了对来自酵母细胞的天然转化酶分子进行改造,以使其适用于工业和医药领域,利用壳寡糖(COS)对酵母转化酶(YInv)的氨基进行修饰.结果发现:COS修饰后的糖链成功连接到转化酶肽链的氨基上,修饰酶(COS-Inv)的分子量比天然酶(YInv)的明显增大;COS-Inv的催化活性比YInv的提高200.3％.YInv和COS-Inv分子中的多糖含量分别为 2.75 和 6.34 mg/mg.COS-Inv 的Km值(58.92 mmol/L)比 YInv 的Km值(125.45 mmol/L)低得多.YInv和COS-Inv的三维荧光光谱测定结果表明,COS-Inv的荧光强度比YInv的荧光强度低得多,说明COS-Inv与YInv两者的三维分子结构有非常大的差别.由此可见,利用壳寡糖修饰酵母转化酶以改造其分子结构是提高其催化活性的有效办法.

目的 探讨壳寡糖(COS)对糖尿病小鼠免疫功能及炎症因子释放的调节作用.方法 称量小鼠体质量,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测空腹血糖.解剖称重后计算小鼠脾脏指数(脾脏质量/体质量)和胸腺指数(胸腺质量/体质量);使用流式技术检测小鼠眼眶血中T淋巴细胞亚群CD4+和CD8+,并计算CD4+/CD8+;使用ELISA检测小鼠眼眶血中炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、C反应蛋白(CRP)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β和单核细胞趋化蛋白(MCP)-1 水平.结果 2 型糖尿病小鼠建模成功,与对照组相比,模型组体质量明显下降,血糖水平显著升高(P<0.05).且与模型组相比,中、高剂量组体质量显著增加,血糖水平显著降低(P<0.05).与对照组相比,模型组和各剂量组胸腺指数和脾脏指数均显著下降,但各剂量组有所缓解(P<0.05).与对照组相比,模型组和各剂量组CD4+显著下降,模型组下降更加明显(P<0.05),但CD8+均未发生显著变化(P>0.05).与对照组相比,模型组和各剂量组炎症因子TNF-α、CRP、IL-6、IL-1β及MCP-1 水平均显著升高;与模型组相比,各剂量组各炎症因子含量显著下降,且高剂量组显著低于对照组(均P<0.05).结论 COS能够剂量依赖性改善糖尿病小鼠免疫功能抑制和炎症反应.

目的:研究低分子量壳寡糖(low-molecular chitosan oligosaccharide,LMCOS)对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的小鼠颅骨吸收模型的影响,评估其在小鼠颅骨吸收过程中的抑制作用.方法:将6周龄C57/BL6雄性小鼠随机分为5组,即磷酸缓冲液(PBS)组、LPS组、LPS+0.005％ LMCOS组、LPS+0.05％ LMCOS组和LPS+0.5％ LMCOS组;每组5只,LPS的刺激量为10 mg/kg.小鼠浅麻醉后,于颅盖骨皮下注射相应试剂,每只注射300 μL.每周小鼠头部皮下组织和颅骨骨膜之间注射试剂3次,2周后处死,取出颅盖骨进行Micro-CT扫描、H-E染色、TRAP染色.采用SPSS21.0软件包对数据进行单因素方差分析,观察骨破坏面积、破骨细胞的形成等骨缺损表现.结果:Micro-CT扫描、H-E染色、TRAP染色发现,与PBS组相比,LPS组小鼠颅骨表面的骨破坏十分明显;加入不同浓度的LMCOS后,颅骨骨破坏面积及破骨细胞数目随LMCOS浓度的升高而不断减少.结论:LMCOS具有抑制LPS诱导的小鼠颅骨骨吸收的作用,提示LMCOS对骨破坏性疾病可能具有一定的治疗作用.

糖尿病慢性皮肤伤口的愈合,是临床治疗中的难点和基础研究中的热点.传统治疗方法效果并不理想,而组织工程技术的发展,为其治疗提供了新途径.现今已有将壳寡糖作为伤口敷料的研究,并引起越来越多的关注,但关于壳寡糖用于糖尿病难愈性创面的研究并不多.本篇综述将概述壳寡糖促进伤口愈合的生物学机制及特点,以及糖尿病皮肤创面的病理学改变,总结壳寡糖在糖尿病皮肤伤口愈合中的研究进展.

目的 观察壳寡糖对炎症相关性结直肠癌(CAC)的防治效果和对肠道细菌的影响. 方法 32只8～10周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为健康对照组(CK,正常饮食)、壳寡糖对照组(COS,每日灌胃壳寡糖300 mg/kg)、炎症相关性结直肠癌模型组(CAC,氧化偶氮甲烷AOM/葡聚糖硫酸钠DSS诱导炎症相关性结直肠癌)和壳寡糖治疗组(CAC+COS,每日灌胃壳寡糖300 mg/kg的CAC处理组),每组8只.每周称量小鼠体重并测定疾病活动指数(DAI),造模结束时(第10周末)取小鼠结肠组织,进行病理组织学检查和结肠上皮细胞因子COX 2、IL 1β、IL-6、IL-10和TNF-α丰度的RT qPCR检测,以及小鼠粪便中总细菌、乳酸杆菌、肠球菌、具核梭杆菌、丁酸盐产生菌丰度的Real time PCR检测,评估壳寡糖对CAC的防治效果和对肠道细菌的影响. 结果 CAC+ COS组小鼠成瘤率从CAC组的100％下降至71.4％,且小鼠体重下降得到明显改善,实验结束时CAC组小鼠体重为(22.14±1.18)g,CAC+ COS组为(24.84±0.60)g,差异有统计学意义(P＜0.05);CAC组小鼠出现肛门脱垂,CAC+COS组小鼠术出现明显脱肛.CK和COS组小鼠DAI为0;CAC和CCAC +COS组小鼠在实验第1周即出现腹泻等疾病活动特征,但从第4周开始,CAC+COS组小鼠DAI显著降低至实验结束时分别为1.57±0.23和2.67±0.47,与CAC组比较差异有统计学意义(P＜0.05).CAC组小鼠结肠上皮细胞因子COX-2、IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α mRNA较CK和COS组均显著升高,壳寡糖的应用可显著下调上述5种因子的丰度(P＜0.05),△△CT值CAC+COS组分别为3.57±0.90、5.25±0.82、1.26±0.64、1.32±0.25和1.50±0.25,CAC组分别为5.56±0.94,7.99±0.94,3.53±0.48,3.63±0.30和2.78±0.40.CAC组小鼠肠道的肠球菌和具核梭杆菌较CK组显著增加(Lg值分别为3.52±0.18 vs.0.97±0.22,2.06±0.07 vs.1.21±0.06),丁酸产生菌较CK组显著减少(Lg值为1.00±0.21 vs.2.85±0.09)(P＜0.05);而壳寡糖治疗后的CAC+COS组中肠球菌和具核梭杆菌丰度均较CAC组小鼠显著降低(Lg值分别为1.16±0.15 vs.3.52±0.18,1.69±0.20 vs.2.06±0.07),丁酸盐产生菌显著增加(Lg值为2.11±0.22 vs.1.00±0.21). 结论 壳寡糖可通过显著降低小鼠疾病活动指数、成瘤率和改变结肠上皮细胞因子丰度控制小鼠炎症相关性结直肠癌的发生发展,且壳寡糖可显著增加肠道总细菌和丁酸盐产生菌丰度,降低肠球菌和具核梭杆菌的丰度,是预防和治疗炎症相关性结直肠癌的潜在有效药物.

目的 制备由叶酸壳寡糖修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米粒(F-CS-PLGA-NPs),考察其体外对人卵巢癌细胞(SKOV-3)和耐紫杉醇卵巢癌细胞(SKOV-3/TAX)的抑制作用.方法 采用碳二亚胺法制备叶酸耦联的壳寡糖,以此作为普通纳米粒(PLGA-NPs)的向导材料,采用界面沉积法制备F-CS-PLGA-NPs,噻唑蓝(MTT)法测定对SKOV-3和SKOV-3/TAX体外增殖的抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 体外实验结果显示PLGA-NPs和F-CS-PLGA-NPs对SKOV-3/TAX的增殖抑制作用比SKOV-3更不敏感.F-CS-PLGA-NPs对SKOV-3和SKOV-3/TAX的半数抑制浓度(IC50)分别为(23.17±2.45)和(88.81±10.69) nmol·L-1.结论 叶酸壳寡糖对PLGA-NPs的修饰可增加其对耐药肿瘤细胞的靶向性,为耐药肿瘤的治疗提供新的思路.

对来源于枯草芽孢杆菌菌株168(Bacillus subtilis 168)的壳聚糖酶编码基因进行了序列优化及全合成,并在毕赤酵母(Pichia pastoris)中实现了分泌表达,表达产物的蛋白质浓度达到0.30mg/ml.表达的壳聚糖酶最适pH为5.6,最适温度为55℃,比酶活达84.54U/ml.该酶在50℃及以下较稳定.利用该酶水解低脱乙酰度壳聚糖并使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF MS)对产物的组分进行了分离及鉴定.根据一级质谱信息,推测酶解产物中包含至少37种聚合度2 ～18,不同脱乙酰度的壳寡糖组分.综上,利用毕赤酵母分泌表达了来源于枯草芽孢杆菌菌株168的壳聚糖酶基因,利用表达产物水解制备了低脱乙酰度壳寡糖并对其组分进行了分析,可为后续壳寡糖结构与功能关系的研究提供参考.