目的:构建携带含Krüppel样因子4(KLF4)基因的重组慢病毒载体，建立KLF4基因过表达的骨髓间充质干细胞株(BMSCs)，并观察颈动脉损伤后血管增生的变化。方法:以慢病毒为载体介导KLF4基因转染BMSCs。选用10周龄SD大鼠24只，随机分为3组，分别为假手术组、模型组、KLF4组(注入KLF4修饰的BMSCs细胞)。采用球囊导管构建大鼠颈动脉内皮损伤的动物模型，于14 d后股动脉放血处死大鼠，并采用苏木精-伊红(HE)染色法观察各组颈总动脉血管壁厚度变化及形态学变化；采用Griess法检测各组实验大鼠血清中一氧化氮(NO)的含量；采用蛋白质印迹法(Western blot)检测大鼠颈动脉内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、KLF4蛋白的表达水平。组间比较采用单因素方差分析。结果:模型组内皮细胞增生高于假手术组(1.68±0.29比0.01±0.01， F＝244.345， P<0.05)，差异有统计学意义，而KLF4组内皮细胞增生低于模型组(0.14±0.01比1.68±0.29， F＝244.345， P<0.05)。模型组血清中NO浓度明显低于假手术组(7.22±1.40比21.29±1.83， F＝171.000， P<0.05)，差异有统计学意义，而KLF4组NO浓度明显高于模型组(16.34±1.33比7.22±1.40， F＝171.000， P<0.05)，差异有统计学意义。Western blot显示，KLF4/β-肌动蛋白(β-actin)在假手术组、模型组和KLF4组中的比值分别为0.564±0.015、0.626±0.023、0.916±0.042，差异有统计学意义( F＝125.121， P<0.05)；eNOS/β-actin在假手术组、模型组和KLF4组中的比值分别为0.852±0.043、0.383±0.017、0.707±0.014，差异有统计学意义( F＝223.879， P<0.05)。 结论:KLF4可正性调节eNOS的表达，从而增加血管中NO的浓度，通过抑制血管内皮细胞的迁移和增殖来抑制颈动脉损伤造成的血管狭窄。

目的:构建小鼠miR-204过表达重组慢病毒载体，并在二氧化硅（SiO 2）诱导的小鼠肺上皮细胞（MLE-12细胞）中验证miR-204与DVL3的靶向调控作用。 方法:于2019年10月，从小鼠基因组中应用聚合酶链式反应（PCR）法扩增出pre-miR-204基因，测序后将扩增产物克隆到pLenti-CMV-EGFP慢病毒载体，通过PCR筛选及测序对阳性克隆进行鉴定。将miR-204过表达慢病毒载体转染至293T细胞，进行慢病毒的包装和滴度测定，研究分为SiO 2对照组、病毒对照组及miR-204病毒组，实时荧光PCR检测miR-204和DVL3基因的表达。 结果:构建miR-204慢病毒表达载体Lv-miR-204-5p经PCR和测序鉴定正确，并获得滴度为9.57×10 8 IU/ml的病毒稀释液；实时荧光PCR检测结果显示，miR-204病毒组MLE-12细胞中miR-204基因的表达高于SiO 2对照组和病毒对照组，DVL3基因的表达低于SiO 2对照组和病毒对照组，差异均有统计学意义（ P<0.05）。 结论:miR-204过表达慢病毒载体可能在SiO 2诱导的MLE-12细胞中抑制DVL3基因的表达。

目的:构建早老蛋白增强子2（PSENEN）基因沉默的人永生化角质形成细胞（HaCaT）模型，探究PSENEN基因表达下调对HaCaT细胞增殖以及γ分泌酶表达的影响。方法:设计3组靶向PSENEN基因的shRNA序列，与线性化的LV3-pGLV-h1-GFP-puro载体构建慢病毒重组表达质粒，经酶切及测序鉴定后，进行慢病毒的包装、纯化和滴度测定。将HaCaT细胞分为5组进行转染：shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组分别加入含沉默PSENEN基因的shRNA1、shRNA2、shRNA3慢病毒原液，NC组加入含阴性对照shNC慢病毒原液，空白组不加病毒液。转染完成后，荧光显微镜下观察荧光表达，流式细胞仪检测转染效率。CCK8法测定HaCaT细胞增殖活性，实时荧光定量PCR（qPCR）、Western印迹法分别检测PSENEN、呆蛋白（NCT）、早老蛋白1（PS1）、前咽缺陷蛋白1a（APH1a）mRNA、蛋白的相对表达量。统计分析采用重复测量方差分析、单因素方差分析，组间两两比较采用LSD- t检验。 结果:倒置荧光显微镜下观察到shRNA1~shRNA3组、NC组均有荧光表达，流式细胞仪示转染效率均达98%以上。qPCR、Western印迹法显示，与NC组（1.054 ± 0.272、1.076 ± 0.075）相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3组PSENEN mRNA（0.187 ± 0.010、0.163 ± 0.022、0.174 ± 0.009）、蛋白（0.219 ± 0.097、0.208 ± 0.014、0.185 ± 0.062）表达均显著降低（均 P < 0.001）。CCK8法显示，与NC组相比，shRNA1组细胞增殖活性在0、12、36、48 h均显著增高（均 P < 0.05），24和60 h差异无统计学意义（均 P > 0.05）；shRNA2、shRNA3组在0、12、24、36、48、60 h细胞增殖水平均显著高于NC组（均 P < 0.05）。shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组、NC组、空白组间NCT、PS1、APH1a基因mRNA表达差异无统计学意义（ F值分别为8.168、4.644、1.981，均 P > 0.05），mNCT、imNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白相对表达差异有统计学意义（ F值分别为39.268、5.929、27.842、20.663，均 P ≤ 0.01）。与NC组相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3组mNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白表达均显著降低（均 P < 0.01），imNCT蛋白表达变化无统计学意义（均 P > 0.05）。 结论:成功构建了PSENEN基因沉默的HaCaT细胞模型，PSENEN基因沉默会引起HaCaT细胞增殖活性增强，γ分泌酶其他亚基蛋白含量下降。

目的:通过外源性引入IL-6载体，实现在循环中长期高表达IL-6，构建一种慢性系统性炎症的动物模型。方法:构建重组鼠IL-6编码腺相关病毒(IL-6-encoding adeno-associated virus, AAV-IL-6)。24周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为AAV-IL-6组、空白载体对照组、空白对照组，每组各7只，分别在干预开始0、8、16周尾静脉注射100 μl 0.5×10 10 vp/ml的AAV-IL-6、空白载体AAV或相同体积的生理盐水。ELISA检测小鼠血清IL-6水平。观察小鼠一般情况、血常规、血生化、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)。在24周干预结束后处死小鼠，取心肌、肝脏、脾脏、股四头肌、膝关节、股骨中段做HE染色。 结果:在干预后4、8、16及24周，AAV-IL-6组小鼠血清IL-6水平为(75.41~169.28) pg/ml，而两对照组均低于检测下限(7.8 pg/ml)。干预后24周，AAV-IL-6组小鼠体重明显低于两对照组；AAV-IL-6组小鼠中性粒细胞计数和CRP水平均高于两对照组，而白蛋白、肌酐、甘油三酯和胆固醇水平低于两对照组，上述指标在对照组之间差异无统计学意义；AAV-IL-6组及空白载体对照组小鼠淋巴细胞均高于空白对照组；3组小鼠肝、肾功能在干预结束后均正常。组织病理显示，AAV-IL-6组小鼠肝脏中央静脉区及心肌肌纤维间隙、骨骼肌肌纤维间隙灶性淋巴细胞浸润，脾脏弥漫性多核巨细胞浸润；骨骼肌肌纤维萎缩；骺板结构紊乱和软骨增生区变小，骨小梁变薄、稀疏；骨皮质变薄、类骨质减少，两对照组小鼠无相应的组织病理改变表现。结论:通过重复尾静脉注射AAV-IL-6能够实现小鼠长期循环高表达IL-6，初步检测该小鼠具有慢性系统性炎症表型，为相关研究提供了一种安全、有效且相对简单可及的动物模型。

皮肤创面形成后，内源性电场（EF）引导表皮细胞向创面中心定向集体迁移，从而促进创面愈合。这一过程涉及2个功能不同的细胞群体，即领导细胞（leader cell）和随从细胞（follower cell）。在EF引导的集体迁移中，领导细胞的定向极化至关重要，但其潜在的调节机制尚不清楚。陆军军医大学（第三军医大学）西南医院整形外科张家平教授团队在《Burns & Trauma》杂志上发文《CD9 negatively regulates collective electrotaxis of the epidermal monolayer by controlling and coordinating the polarization of leader cells》。研究者首先利用延时显微镜观察到EF以电压依赖的方式引导人永生化KC——HaCaT单层向电场阳极集体迁移；在HaCaT单层的前端，领导细胞沿着迁移的方向动态形成伪足。免疫荧光染色显示，EF处理组HaCaT细胞中极化的F?肌动蛋白较对照组增加了3.4倍（P<0.05），证实极化的F?肌动蛋白在伪足形成中发挥重要作用。接着，研究者观察到CD9在HaCaT细胞膜上与F?肌动蛋白共定位；并且EF处理组HaCaT细胞的CD9水平较对照组显著降低（P<0.01）。随后，研究者利用过表达CD9的重组腺病毒转染，构建了过表达CD9的HaCaT（Ad?CD9），并观察到CD9的过表达会抑制EF引导下领导细胞中F?肌动蛋白的极化和HaCaT单层的集体迁移（P<0.001）。研究者进一步探究其机制，证实EF通过下调CD9以激活ADAM17/肝素结合表皮生长因子（HB?EGF）/EGF受体，引起F?肌动蛋白的极化，从而诱导领导细胞的产生，并促进细胞的定向集体迁移。最后，在正常HaCaT细胞和Ad?CD9混合的共培养单层中，研究者观察到CD9过表达导致的领导细胞极化障碍能够恢复至正常细胞水平（P<0.01）；然而，加入HB?EGF中和抗体后，领导细胞再次出现极化障碍（P<0.01）。综上，该文首次揭示了EF引导的HaCaT单层集体迁移的机制，也为急慢性创面的治疗提供了潜在的靶点。

目的:研究p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）基因沉默对大气细颗粒物（PM 2.5）染毒肝细胞（L02细胞）相关基因表达的影响。 方法:于2019年6至9月，根据GenBank提供的p38MAPK基因序列，设计合成3条干扰序列，退火后连接到PLVX-shRNA2-puro中，将重组慢病毒载体转染L02细胞。用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）和蛋白免疫印迹（Western blotting）法对p38MAPK基因沉默效果进行鉴定。用浓度为50 μg/ml的PM 2.5水溶物和10 μmol/L阳性对照Cr 6+分别染毒L02细胞、p38MAPK基因沉默细胞24 h，同时设立空白对照组。用荧光定量PCR检测癌基因（c-fos、c-myc、k-ras）、抑癌基因（p53）和凋亡基因（Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9）的相对表达水平。 结果:p38MAPK基因沉默细胞中p38MAPK基因和蛋白表达水平较正常L02细胞明显下降（ P<0.05），p38MAPK基因沉默细胞株构建成功。与空白对照组比较，PM 2.5染毒L02细胞组癌基因c-fos、c-myc、k-ras和凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达水平升高，抑癌基因p53表达水平下降，差异均有统计学意义（ P<0.05）；与PM 2.5染毒L02细胞组比较，PM 2.5染毒p38MAPK基因沉默细胞组癌基因c-fos、c-myc、k-ras和凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达水平下降，抑癌基因p53表达水平升高，差异均有统计学意义（ P<0.05）。 结论:PM 2.5对L02细胞癌基因、抑癌基因和凋亡基因表达有明显影响，而p38MAPK基因沉默可抑制PM 2.5对L02细胞的影响。

目的:探讨长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNA)Gm13568对A1型星形胶质细胞活化及实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠疾病进程的影响与分子机制。方法:构建特异性靶向星形胶质细胞的lncRNA Gm13568沉默与对照的重组慢病毒载体，分别命名为LV-Inhibit-Gm13568和LV-ctrl，并包装病毒。1×10 7 TU病毒悬液静脉注射入C57BL/6小鼠体内7 d后，髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55，MOG 35-55)多肽诱导EAE模型。实验分为PBS组、EAE组、LV-ctrl+EAE组和LV-Inhibit-Gm13568+EAE组，采用双盲法每日对小鼠进行神经功能评分。EAE小鼠诱导后23 d，取各组小鼠脊髓组织，利用real-time PCR测定A1型星形胶质细胞活化指标Serping 1、C3、Srgn和H2-T23的mRNA转录水平，同时测定IL-6、TNF-α、巨噬细胞趋化蛋白-1(macrophage chemotactic protein-1, MCP-1)和干扰素诱导蛋白-10(interferon-inducible protein-10, IP-10)的生成变化；Western blot检测脊髓组织胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和Notch1的表达及信号转导与转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的磷酸化水平(phosphorylated STAT3, p-STAT3)；免疫荧光法检测各组脊髓组织中Notch1活化后的胞内段蛋白(Notch1 intracellular domain，NICD)与GFAP的共表达；HE和劳克坚牢蓝染色(Luxol fast blue，LFB)分别观察脊髓组织内炎症细胞浸润及髓鞘脱失变化。 结果:与PBS组比较，EAE组和LV-ctrl+EAE组小鼠A1型星形胶质细胞活化增生，Notch1的表达显著上调。沉默内源性lncRNA Gm13568后，与LV-ctrl+EAE组比较，小鼠的神经功能评分在抗原诱导后23 d从平均3.5分下降至1分以下，临床症状缓解，A1型星形胶质细胞活化降低，同时炎性因子及趋化因子生成减少；Notch1、GFAP、NICD的蛋白质表达水平和STAT3的磷酸化水平显著降低；小鼠脊髓组织炎性细胞浸润与髓鞘脱失显著减轻。结论:LncRNA Gm13568可能通过调控Notch1/STAT3信号调控A1型星形胶质细胞的活化，从而调节炎性因子及趋化因子的产生，参与EAE的病变进程。

目的:构建大鼠RNAi-腺苷A2a受体(A2aR)慢病毒载体并进行鉴定。方法:首先构建3对短发夹RNA(shRNA)-A2aR序列(shRNA-A2aR 1、shRNA-A2aR 2、shRNA-A2aR 3)，在shRNA慢病毒载体中分别插入3对双链shRNA oligo，shRNA慢病毒重组质粒构建成功后，将重组质粒、包装载体、穿梭载体共转染293T细胞，从而获得病毒液。实验Ⅰ　采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为3组( n＝6)：空载组(V组)、shRNA-A2aR 1组和shRNA-A2aR 3组，各组分别转染MOI为10的相应病毒液，转染48 h时，Western blot法检测A2aR表达水平，确定干扰效率，以筛选最佳慢病毒载体。实验Ⅱ　采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为5组( n＝36)：空载组(V组)、MOI5组、MOI10组、MOI15组和MOI20组，各组分别转染相应MOI的病毒液(最佳慢病毒载体)，于转染24、48和72 h时，采用CCK-8法测定细胞存活率，荧光显微镜下观察细胞活力和细胞死亡情况，Western blot法检测A2aR表达水平，确定干扰效率。 结果:实验Ⅰ　成功构建了2种shRNA-A2aR慢病毒载体(shRNA-A2aR 1、3)。shRNA-A2aR 3病毒液滴度为3.5×10 8 TU/ml。与V组和shRNA-A2aR 1组比较，shRNA-A2aR 3组心肌细胞A2aR表达下调( P<0.01)，shRNA-A2aR 3慢病毒载体干扰效率73%。实验Ⅱ　选择shRNA-A2aR 3慢病毒载体转染24 h时，各组细胞存活率均>85%；转染48 h时，MOI5组和MOI10组细胞存活率>80%；转染72 h各组细胞存活率<70%。倒置荧光显微镜下可见，MOI5组荧光密度稍低，MOI10组转染48 h及MOI20组转染24 h时，荧光密度较高且细胞状态较好；转染72 h时各组心肌细胞活力明显下降、死亡细胞增加。Western blot显示：MOI10组转染48 h、MOI15组转染48 h、MOI20组转染24和48 h时干扰效率均>70%。 结论:成功构建了大鼠shRNA-A2aR慢病毒载体，且MOI为10、转染48 h或MOI为20、转染24 h为最佳转染方案。

目的:探索小鼠心肌细胞中哺乳动物不育系20样激酶1（mammalian sterile 20-like kinase 1，Mst-1）调控缺氧复氧（hypoxia reoxygenation，HR）诱导的心肌细胞自噬及凋亡机制。方法:采用酶消化法结合差速贴壁的方法培养小鼠乳鼠心肌细胞，通过缺氧24 h复氧6 h的方法建立HR模型。实验分组：对照组：正常培养的心肌细胞；Mst-1空病毒组：用重组慢病毒空载体转染心肌细胞48 h；Mst-1敲低组：用携带Mst-1小干扰RNA（siRNA）的重组慢病毒转染心肌细胞48 h；Mst-1过表达组：用携带Mst-1基因的重组慢病毒转染心肌细胞48 h；HR组：建立心肌细胞HR模型；Mst-1敲低+HR组：用携带Mst-1 siRNA的重组慢病毒转染心肌细胞后48 h建立心肌细胞HR模型；Mst-1过表达+HR组：用携带Mst-1基因的重组慢病毒转染心肌细胞后48 h建立心肌细胞HR模型。采用实时荧光定量RCR（qPCR）以及Western blot检测细胞中Mst-1 mRNA及蛋白相对表达量，免疫荧光染色检测心肌细胞标志物心肌肌钙蛋白T（cTnT），及细胞自噬体与自噬溶酶体变化，脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）法检测心肌细胞凋亡水平，Western blot检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）Ⅱ/LC3Ⅰ，P62及凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸酶剪切体（cleaved-caspase）9、半胱氨酸天冬氨酸酶前体（pro-caspase）9、cleaved-caspase-3、pro-caspase-3，以及髓细胞白血病1基因（MCL-1）的表达情况达。予以MCL-1抑制剂A1210477做回复实验，验证Mst-1通过调控MCL-1参与心肌细胞凋亡及自噬。结果:免疫荧光检测发现培养细胞表达心肌细胞特异性标志物cTnT；HR情况下心肌细胞中Mst-1表达增加，慢病毒转染可有效抑制或过表达细胞中Mst-1。HR组与Mst-1过表达+HR组心肌细胞内自噬体及自噬溶酶体含量低于对照组，而Mst-1敲低+HR组心肌细胞内自噬体及自噬溶酶体含量高于HR组（ P均<0.05）。TUNEL结果显示，HR组及Mst-1过表达+HR组中TUNEL阳性细胞比例高于对照组，而Mst-1敲低组+HR组中TUNEL阳性细胞比例低于HR组（ P均<0.05）。Western blot结果显示，与对照组比较，HR组及Mst-1过表达+HR组细胞中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ值较低，P62与 cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3表达水平较高（ P均<0.05）；与HR组比较，Mst-1敲低+HR组中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ值较高，P62与cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3表达水平较低（ P均<0.05）。HR与Mst-1过表达+HR组心肌细胞中磷酸化（P）MCL-1蛋白表达水平低于对照组，Mst-1敲低+HR组的P-MCL-1蛋白表达水平高于HR组（ P均<0.05）。回复实验显示抑制细胞中MCL-1可阻断Mst-1 siRNA 对细胞自噬及凋亡的调节作用。 结论:抑制心肌细胞中Mst-1的表达，可促进HR诱导的心肌细胞自噬，改善心肌细胞凋亡，该作用可能与其调控MCL-1表达相关。

目的:探讨微小RNA(microRNA)-4320对胃癌MGC803细胞增殖、迁移的影响及机制。方法:分别采用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测miR-4320在4种胃癌细胞株(MGC803、HS-746T、SGC7901、BGC823)中的表达情况。将携带miR-4320干扰片段的重组慢病毒和空白慢病毒感染MGC803细胞，设为si-miR-4320组和NC组。噻唑蓝比色法和Transwell小盒实验分别检测下调miR-4320后MGC803细胞增殖和迁移情况。生物信息学软件RNAhybrid预测miR-4320目的基因。通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-4320与目的基因的靶向关系。分别采用qRT-PCR和Western blot检测miR-4320目的基因的表达。计量数据以均数±标准差( ± s)表示，组间比较应用 t检验或单因素方差分析。 结果:4种胃癌细胞株miR-4320的表达均显著高于正常胃黏膜上皮细胞( P<0.01)。NC组和si-miR-4320组MGC803细胞中miR-4320表达分别为8.19±1.00和1.09±0.31，miR-4320干扰片段显著降低miR-4320的表达( P<0.01)。si-miR-4320组MGC803细胞的吸光度明显低于NC组( P<0.05)，迁移能力明显低于NC组( P<0.01)。细胞因子信号抑制因子( SOCSI)是miR-4320的目的基因( P<0.01)。与NC组相比，si-miR-4320组SOCS1基因表达明显上调( P<0.01)。 结论:miR-4320在胃癌细胞株中表达升高，下调miR-4320的表达能够通过诱导SOCS1基因表达，抑制胃癌MGC803细胞的增殖及迁移能力。