目的:桃红四物汤调控核因子E2相关因子(Nrf2)/Kelch样ECH关联蛋白1(Keap1)/血红素氧合酶-1(HO-1)信号通路介导的铁死亡在膝骨关节炎(KOA)中的作用机制.方法:40只SD大鼠随机分为假手术对照组、模型对照组、桃红四物汤9 g/kg组、双醋瑞因胶囊0.0045 g/kg组,每组各10只;各组均采用内侧半月板失稳手术造模,造模成功1 w后各组灌胃给予相应的药物或无菌水,1次/d,连续8 w.干预完成后,检测各组大鼠血清白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-18含量及关节软骨组织丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、活性氧(ROS)含量;透射电镜观察大鼠软骨线粒体数量、形态、结构及分布情况;Western Blot法检测大鼠关节软骨组织Keap1、Nrf2、HO-1、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、肿瘤抑制蛋白53(P53)、溶质载体家族7成员11重组蛋白(SLC7A11)的表达.结果:与假手术对照组比较,模型对照组Mankin和OARSI病理评分增加,IL-1β、TNF-α、IL-18、MDA、ROS含量显著升高,Keap1、P53蛋白表达显著上调,SOD活力显著降低,Nrf2、HO-1、GPX4、SLC7A11蛋白表达显著下调(P＜0.01);与模型对照组比较,桃红四物汤组Mankin和OARSI病理评分降低,IL-1β、TNF-α、IL-18、MDA、ROS含量降低,Keap1、P53蛋白表达显著下调,SOD活力显著升高,Nrf2、HO-1、GPX4、SLC7A11蛋白表达显著上调(P＜0.01).结论:桃红四物汤可能通过激活Nrf2/Keap1/HO-1信号通路抑制大鼠关节软骨铁死亡.

目的:探讨含Jumonji结构域蛋白3(JMJD3)-干扰素调节因子4(IRF4)信号通路介导的巨噬细胞极化对多发性骨髓瘤(MM)细胞恶性生物学行为的影响.方法:佛波酯(PMA)诱导THP-1单核细胞分化为巨噬细胞,将THP-1巨噬细胞分为对照组(正常培养)、M2诱导组(添加重组人IL-4、IL-13蛋白)、M2+JMJD3蛋白组(添加重组人IL-4、IL-13和JMJD3蛋白)和M2+JMJD3抑制剂组(添加重组人IL-4、IL-13蛋白和JMJD3抑制剂),流式细胞术检测CD206+细胞比例,ELISA检测培养上清液中IL-10、转化生长因子-β(TGF-β)水平,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中精氨酸酶-1(Arg-1)、JMJD3、IRF4 mRNA表达水平,免疫印迹(Western blot)检测Arg-1、JMJD3、IRF4蛋白表达水平.相应地,使用各组THP-1巨噬细胞培养上清液培养人MM细胞U266,MTT法、平板克隆形成实验检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western blot检测细胞中促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved caspase-3)表达水平,Transwell实验检测细胞迁移、侵袭情况.结果:与对照组比较,M2诱导组THP-1巨噬细胞中CD206+细胞比例,Arg-1、JMJD3、IRF4 mRNA和蛋白表达水平以及细胞培养上清液中IL-10、TGF-β水平明显升高(P＜0.001),同时U266细胞增殖活力、集落形成数明显增加(P＜0.01),细胞凋亡率以及促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3表达水平明显降低(P＜0.001),迁移、侵袭细胞数明显增多(P＜0.001).与M2诱导组比较,M2+JMJD3蛋白组THP-1巨噬细胞中CD206+细胞比例,Arg-1、JM-JD3、IRF4 mRNA和蛋白表达水平以及细胞培养上清液中IL-10、TGF-β水平均进一步升高(P＜0.01),同时U266细胞增殖活力、集落形成数明显升高(P＜0.05),细胞凋亡率以及促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3表达水平明显降低(P＜0.01),迁移、侵袭细胞数明显增多(P＜0.001);而M2+JMJD3抑制剂组上述各指标变化趋势与M2+JMJD3蛋白组相反.结论:JMJD3-IRF4信号通路介导的巨噬细胞M2极化能够促进MM细胞增殖、迁移和侵袭,并抑制细胞凋亡.

目的:探讨苦杏仁苷(AMG)对脂多糖(LPS)诱导的心肌细胞炎症反应的影响及对高迁移率族ATHook蛋白1(HMGA1)/核因子-κB(NF-κB)信号通路的调节机制.方法:将H9c2心肌细胞分为对照组、LPS组、AMG低剂量组、AMG高剂量组、AMG高剂量+重组HMGA1组(AMG高+HMGA1组).采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测心肌细胞的增殖活性;流式细胞术检测心肌细胞凋亡率;酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养液炎性因子白细胞介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测心肌细胞HMGA1/NF-κB通路相关蛋白的表达.结果:与对照组比较,LPS组心肌细胞存活率、NF-κB抑制蛋白α(IкBα)蛋白表达降低,心肌细胞凋亡率、炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量、HMGA1蛋白和NF-κB p65、IκBα磷酸化水平升高(P＜0.05).与LPS组比较,AMG各剂量组心肌细胞存活率、IκBα蛋白表达升高,心肌细胞凋亡率、炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量、HMGA1蛋白和NF-κB p65、IκBα磷酸化水平降低(P＜0.05),且HMGA1过表达可逆转AMG对心肌细胞的保护作用(P＜0.05).结论:AMG通过抑制HMGA1/NF-κB信号通路,减轻LPS诱导的心肌细胞炎症反应.

目的:构建针对大肠埃希菌的重组发光噬菌体（HT7），并评估其对大肠埃希菌的鉴定能力。方法:首先通过基因工程构建小向导RNA表达质粒pCRISPR-sg（1~10）和PFN-1000同源重组质粒菌株，并用双层平板筛选切割效率最高的小向导RNA（sgRNA）；采用同源重组与规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）系统联合介导的基因编辑技术，将Nanoluc萤光素酶基因整合入T7噬菌体10A基因下游的非编码区，并成功构建发光噬菌体HT7；通过噬菌斑实验和液体扩增实验评估HT7噬菌体与T7噬菌体生物特性差异；此外用2022年1月至2023年6月解放军总医院第一医学中心临床采集分离的51株大肠埃希菌、20株肺炎克雷伯菌、14株金黄色葡萄球菌、6株屎肠球菌、5株粪肠球菌、3株鲍曼不动杆菌和1株铜绿假单胞菌评估HT7噬菌体的检测专一性和检出限。结果:构建的10个CRISPR靶向切割系统中，sgRNA8靶标的切割效率最高，成斑效率为0.18；噬菌体经pCas9/pCRISPR/PFN-1000 3质粒系统3轮重组筛选后，PCR验证均为2 798 bp的重组噬菌体条带，说明成功构建了HT7噬菌体。重组噬菌体在裂解效率（ P<0.001）、一步生长曲线（ P=0.001）、感染复数（ P=0.031）的生物特性分析中，均有显著差异，裂解暴发点和对数生长节点均延长了10 min，最佳感染复数为0.1；临床样本测试，可识别裂解6株大肠埃希菌，其余菌株均不裂解，4.5 h内可检出低于10 CFU/ml的病原菌。 结论:成功开发了一种高效的噬菌体基因编辑系统，并成功构建发光噬菌体HT7，该噬菌体在4.5 h内能特异性检测出低于10 CFU/ml的大肠埃希菌，且对其他菌株无裂解作用，显示出良好的检测专一性和低检出限。

目的:探讨原发免疫性血小板减少症（ITP）患者外周血中高迁移率族蛋白B1（HMGB1）对Th17/Treg平衡的影响。方法:收集大同市第五人民医院2017年7月至2018年4月初诊的ITP患者30例作为病例组，另取同期30名健康体检者作为对照组。应用流式细胞术检测Th17和Treg细胞比例，应用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定外周血中HMGB1、白细胞介素17（IL-17）和转化生长因子β（TGF-β）的浓度。分选外周血单个核细胞（PBMC）进行体外培养，经重组人HMGB1（rhHMGB1）处理后，应用实时荧光定量聚合酶链反应检测胞内Treg细胞转录因子叉头状螺旋转录因子3（Foxp3）和Th17细胞转录因子孤核受体γt（RORγt）mRNA表达的变化。比较两组Treg细胞转录因子外周血中各指标的差异，分析HMGB1和Th17/Treg平衡间的关系。结果:与健康对照组相比，ITP患者外周血中Th17细胞比例及HMGB1、IL-17表达水平增高（均 P<0.01），而Treg细胞比例和TGF-β水平降低（均 P<0.01）。Th17细胞比例和IL-17与HMGB1表达水平均呈正相关（均 P<0.01）；Treg细胞比例和TGF-β水平与HMGB1表达水平均呈负相关（均 P<0.01）。体外实验中，PBMC经rhHMGB1刺激后，胞内RORγt mRNA表达较阴性对照组增高（1.50±0.24比0.93±0.22， t=9.612， P<0.01），而Foxp3 mRNA表达较阴性对照组降低（0.72±0.19比1.08±0.18， t=7.387， P<0.01）。 结论:ITP患者外周血中高水平的HMGB1诱导Th17/Treg失衡，加剧炎症反应，可能是原发ITP的重要病因。

目的:探讨重组人突触融合蛋白4(STX4)对脂多糖(LPS)诱导的胰岛β细胞INS-1损伤影响。方法:胰岛β细胞INS-1分成Control组(空白对照)、LPS组(LPS处理)、LPS+NC组(转染阴性对照载体，LPS处理)、LPS+STX4组(转染pcDNA-STX4，LPS处理)，RT-qPCR和Western blot检测STX4 mRNA和蛋白质表达，流式细胞术检测凋亡，DCFHDA法检测活性氧簇(ROS)水平、黄嘌呤氧化法检测超氧化物歧化酶(SOD)水平、比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平、钼酸铵比色法检测过氧化氢酶(CAT)水平、硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)水平，ELISA法检测细胞分泌的白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平和葡萄糖条件下胰岛素分泌水平，Western blot法检测Cleaved Caspase-3、Bax、p65蛋白质表达。用NF-κB信号通路激活剂处理上调STX4后的胰岛β细胞INS-1，给予LPS刺激，同样利用上述方法测定细胞凋亡、ROS、SOD、GSH-Px、CAT、MDA水平和分泌的IL-1β、TNF-α、胰岛素水平以及Cleaved Caspase-3、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、p65蛋白质水平。结果:与Control组比，LPS组胰岛β细胞中STX4 mRNA和蛋白质表达均减少，细胞凋亡率、ROS水平、MDA水平均升高，SOD、GSH-Px、CAT水平均降低，细胞分泌的IL-1β、TNF-α水平均升高，细胞分泌的胰岛素水平降低，Cleaved Caspase-3、Bax、p65蛋白质表达水平也升高。NF-κB信号通路激活剂处理逆转上调STX4对LPS条件下胰岛β细胞凋亡、ROS、SOD、GSH-Px、CAT、MDA水平和分泌的IL-1β、TNF-α、胰岛素水平以及Cleaved Caspase-3、Bax、p65蛋白质水平影响。结论:上调STX4抑制LPS诱导的胰岛β细胞氧化损伤、细胞凋亡和炎症因子释放，机制与降低NF-κB信号通路激活水平有关。

目的:对1个遗传性抗凝血酶（AT）缺陷症患者所携带的复合杂合突变进行分子机制研究。方法:先证者因“突发晕厥并四肢抽搐一天”于2018年11月就诊于温州医科大学附属第一医院。采集先证者及其家系成员（共3代9人）外周静脉血并进行家系调查。采用发色底物法检测AT活性（AT：A），免疫比浊法检测AT抗原（AT：Ag）。对SERPINC1基因进行直接测序以确定突变位点。利用多种计算机工具预测突变的保守性和疏水性变化。构建重组质粒表达载体并瞬时转染HEK293T细胞以进行体外过表达研究。采用Western Blotting、ELISA和细胞免疫荧光实验对重组AT蛋白进行体外表征。结果:先证者为一例21岁男性。AT：A为 33%，AT：Ag同步下降，属于Ⅰ型AT缺陷症。基因分析显示先证者在第2和第5外显子分别携带c.318_319insT（p.Asn107*）杂合插入突变和c.922G>T（p.Gly308Cys）杂合错义突变。该两个突变位点在同源物种中均完全保守；疏水性分析表明，p.Gly308Cys突变可能降低氨基酸残基307-313的亲水性。体外表达显示，重组蛋白AT-G308C在转染细胞裂解液和培养上清中的含量分别降低至46.98%±2.94%和41.35%±1.48%；经蛋白酶体抑制剂（MG132）处理后，Western Blotting分析显示在细胞质中的AT-G308C蛋白量恢复到与野生型相似的水平；在细胞裂解液和培养上清中均未检测到重组蛋白AT-N107*。结论:p.Asn107*杂合插入突变和p.Gly308Cys杂合错义突变与该家系先证者AT水平降低有关。p.Asn107*杂合插入突变可能触发无义突变介导的mRNA降解，从而消除异常转录本；p.Gly308Cys杂合错义突变可能通过改变局部残基的疏水性导致AT蛋白在细胞质中发生蛋白酶体依赖性降解。

目的:开发一种基于重组酶介导的等温扩增（RAA）和成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白（Cas13a）系统的幽门螺杆菌核酸检测体系。方法:选取2021—2022年于应急总医院收集的30株幽门螺杆菌以及大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌各2株。针对幽门螺杆菌UreC基因保守区序列，设计RAA-Cas13a 核酸检测体系所需的特异性引物及CRISPR RNA（crRNA）。再通过琼脂糖凝胶电泳筛选出产生非特异性产物最少的引物对，并应用Cas13a切割荧光探针产生的荧光强度筛选出切割效率最高的crRNA序列，构建了RAA-Cas13a核酸检测体系，通过检测梯度浓度稀释的幽门螺杆菌ATCC 43504基因组DNA以及5种不同的临床常见病原体基因组DNA，评价基于RAA-Cas13a核酸检测体系的最低检测限及特异性。通过RAA-Cas13a核酸检测体系与已建立的荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）方法同时检测临床菌株，得到该方法与qPCR方法的一致性。采用双侧配对 t检验对两组间的荧光值进行比较， P<0.05为差异有统计学意义。 结果:建立的RAA-Cas13a核酸检测系统可以在1 h内检测出低至10拷贝/μl的靶标DNA（ t=11.05， P<0.01），且与其他5种临床常见菌株无交叉反应。RAA-Cas13a方法与传统的qPCR方法具有良好的一致性，Kappa系数为1。 结论:建立了一种将RAA与CRISPR-Cas13a结合进行幽门螺杆菌检测的方法，可用于快速且灵敏的识别幽门螺杆菌感染。

目的:探讨肺炎克雷伯菌(KP)外膜蛋白A(OmpA)和黏附素MrkD优势抗原表位融合蛋白对KP感染小鼠的免疫保护作用。方法:根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP ompA和mrkD序列，通过生信分析选取这两个蛋白的优势抗原表位，经融合聚合酶链反应(PCR)扩增表位序列后克隆至pColdI载体，并转入本科室保存的大肠杆菌BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，Ni ＋层析凝胶纯化后获得重组蛋白rAD。rAD经皮下免疫22只BALB/c小鼠，同时设置22只佐剂对照组。完成免疫程序后通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对小鼠血清中的抗体水平和脾脏体外抗原刺激后细胞因子分泌水平进行测定，并对小鼠鼻腔注射KP，观察免疫后的小鼠存活率和肺脏细菌数量。组间比较采用 t检验。 结果:分别扩增出ompA和mrkD抗原表位序列，并成功融合，融合片段大小为1 056 bp，与预测大小一致，克隆至pColdI载体后测序，测序正确。重组表达菌BL21(DE3)-pColdI-rAD经IPTG诱导后破碎收集上清纯化，获得可溶性rAD，大小为38.4×10 3，与预测大小一致。rAD 3次免疫BALB/c小鼠后，免疫组抗体滴度显著高于对照组(170 667.00±59 121.00比0.00±0.00， t＝5.00， P<0.01)。KP感染小鼠后，免疫组小鼠存活率显著高于对照组[(65.00±5.00)%比(0.00±0.00)%， t＝22.52， P<0.01]，免疫组小鼠肺脏细菌数显著低于对照组[(9 500.00±1 384.00) CFU比(87 833.00±25 365.00) CFU， t＝7.55， P<0.01]。脾细胞分离后经rAD刺激，免疫组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)分泌量均显著高于对照组[(115.70±17.21) pg/ml比(24.00±9.17) pg/ml， t＝8.14， P<0.01；(200.30±8.51) pg/ml比(9.00±3.00) pg/ml， t＝36.75， P<0.01；(92.33±6.11) pg/ml比(9.67±1.53) pg/ml， t＝22.73， P<0.01]。 结论:KP OmpA和MrkD优势抗原表位融合蛋白rAD，免疫BALB/c小鼠有助于对KP感染的抵抗。

目的:构建携带含Krüppel样因子4(KLF4)基因的重组慢病毒载体，建立KLF4基因过表达的骨髓间充质干细胞株(BMSCs)，并观察颈动脉损伤后血管增生的变化。方法:以慢病毒为载体介导KLF4基因转染BMSCs。选用10周龄SD大鼠24只，随机分为3组，分别为假手术组、模型组、KLF4组(注入KLF4修饰的BMSCs细胞)。采用球囊导管构建大鼠颈动脉内皮损伤的动物模型，于14 d后股动脉放血处死大鼠，并采用苏木精-伊红(HE)染色法观察各组颈总动脉血管壁厚度变化及形态学变化；采用Griess法检测各组实验大鼠血清中一氧化氮(NO)的含量；采用蛋白质印迹法(Western blot)检测大鼠颈动脉内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、KLF4蛋白的表达水平。组间比较采用单因素方差分析。结果:模型组内皮细胞增生高于假手术组(1.68±0.29比0.01±0.01， F＝244.345， P<0.05)，差异有统计学意义，而KLF4组内皮细胞增生低于模型组(0.14±0.01比1.68±0.29， F＝244.345， P<0.05)。模型组血清中NO浓度明显低于假手术组(7.22±1.40比21.29±1.83， F＝171.000， P<0.05)，差异有统计学意义，而KLF4组NO浓度明显高于模型组(16.34±1.33比7.22±1.40， F＝171.000， P<0.05)，差异有统计学意义。Western blot显示，KLF4/β-肌动蛋白(β-actin)在假手术组、模型组和KLF4组中的比值分别为0.564±0.015、0.626±0.023、0.916±0.042，差异有统计学意义( F＝125.121， P<0.05)；eNOS/β-actin在假手术组、模型组和KLF4组中的比值分别为0.852±0.043、0.383±0.017、0.707±0.014，差异有统计学意义( F＝223.879， P<0.05)。 结论:KLF4可正性调节eNOS的表达，从而增加血管中NO的浓度，通过抑制血管内皮细胞的迁移和增殖来抑制颈动脉损伤造成的血管狭窄。