镉(Cd)胁迫严重限制植物生长,因此鉴定与植物镉胁迫耐受性相关的基因尤为重要.课题组前期通过转录组数据筛选获得番茄UDP-糖基转移酶基因(SlUDP)响应植株镉胁迫反应.本研究克隆SlUDP基因编码区全长序列,该基因在叶片和果实中表达量较高,受镉胁迫诱导上调表达.酵母耐镉性分析表明,转入SlUDP基因提高了酵母镉胁迫的耐受性.进一步获得SIUDP过表达拟南芥株系,CdCl2胁迫下(40、60、80μmol/L),与野生型相比,过表达拟南芥株系的子叶失绿程度下降;发芽率、根长和种子存活率提高,而丙二醛含量下降,可溶性糖含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性增加,且金属离子转运蛋白基因ZIP1、IRT1、CSD1和COPT2的表达水平显著高于野生型.结果表明,SlUDP过表达株系通过调节抗氧化酶系统,提高植株清除活性氧能力,降低膜脂过氧化程度,提高金属离子转运等方面提高植株耐镉性.本研究为糖基转移酶基因在植物耐受镉胁迫中的作用研究提供一定的理论依据,并为园艺植物抗性分子育种提供了候选基因.

[目的]PISTILLATA(PI)基因属于典型的Type II型MADS-box基因家族成员,是ABC(D)E模型中的B类基因,在植物发育过程中起着重要作用,但辣椒PI同源基因功能研究未见报道.探索辣椒PI基因功能,为深入研究植物PI同源基因的功能机制奠定基础.[方法]利用RT-PCR的方法从一年生辣椒(Capsicum annuum L.)花器官的cDNA中克隆PI同源基因CaPI,并通过生物信息学方法分析其理化性质、亚细胞定位、蛋白结构和系统进化关系;利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析基因在辣椒不同组织中的表达特征;构建植物过表达载体 35S:CaPI,通过floral-dipping法转化拟南芥.[结果]该基因开放阅读框648 bp,编码 215 个氨基酸,相对分子质量为 25.13 kD.氨基酸多重序列比对表明,CaPI蛋白N端含有"MGRGKIEIKRIEN"保守基序.系统进化树分析证实,CaPI与马铃薯、番茄和矮牵牛的PI同源基因亲缘关系较近.RT-qPCR证实CaPI主要在花中表达,在花萼中表达量最高,其次是花瓣,在雄蕊中低表达,而在雌蕊中几乎不表达.在拟南芥中过表达CaPI,与野生型拟南芥(Col-0)相比,35S:CaPI转基因植株表现出莲座叶和分枝数量增多等表型,但不影响花器官的发育.[结论]辣椒CaPI具有促进植物分枝发育的功能.

[目的]蛋白磷酸酶 2C(protein phosphatase 2C,PP2C)是动植物中均存在的一类蛋白磷酸酶,拟探究其在西瓜果实成熟过程中发挥的重要作用.[方法]通过逆转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)从栽培类型西瓜'97103'中克隆ClPP2C3,并对其进行生物信息学、表达模式和亚细胞定位分析.[结果]西瓜ClPP2C3 的cDNA序列长度为 1 317 bp,编码 438 个氨基酸,其分子量大小为 47.81 kD,蛋白质等电点为 5.12.ClPP2C3 包含 1 个PP2C保守结构域,与负调控果实成熟的番茄SlPP2C3、草莓FaABI1 具有较高的同源性.西瓜ClPP2C3在细胞核表达.ClPP2C3在含糖量高的栽培品种中表达量显著高于含糖量低的野生品种.栽培品种ClPP2C3的 2 kb片段长度启动子活性显著高于野生品种,而 1 kb片段长度启动子活性之间无显著差异.[结论]由 1-2 kb区间SNP导致的启动子活性差异对不同含糖量品种ClPP2C3表达量存在影响.

八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,PSY)是植物类胡萝卜素合成途径中的第一个限速酶,对植物的生长发育具有重要作用.为了解菠菜(Spinacia oleracea L.)中PSY基因家族功能,本研究通过生物信息学方法对菠菜PSY基因家族成员的数目、结构、启动子元件、氨基酸特性和基因进化等进行鉴定分析,并利用实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)分析其在菠菜组织中及响应红蓝光比例变化的表达模式,同时测定R1B3(红光∶蓝光=1∶3)和R3B1(红光∶蓝光=3∶1)处理后菠菜总类胡萝卜素含量,进行SoPSYs基因表达量与总类胡萝卜素含量变化的相关性分析.结果显示,菠菜共有 4 个PSY基因,含有SQS_PSY保守结构域,SoPSY蛋白为亲水性蛋白.菠菜PSY1、PSY2和苋科的甜菜进化关系较近,PSY3、PSY4与番茄PSY3有较近的亲缘关系.菠菜PSY基因启动子序列上存在多种光响应和植物激素相关元件.SoPSY基因具有组织表达特异性,SoPSY1、SoPSY2、SoPSY3仅在叶片中表达,SoPSY4 主要在根中表达.菠菜类胡萝卜素含量在R1B3 和R3B1 处理后均下降.不同基因型菠菜中,各SoPSY基因响应红蓝光比例变化的表达模式具有差异性,其中SoPSY1 的表达在栽培类型菠菜中无显著变化,SoPSY2 的表达模式在两种类型菠菜中相反,SoPSY3在野生型与栽培型菠菜中表达模式一致,且这 3 个基因的相对表达水平与总类胡萝卜素含量变化密切相关.本研究为深入了解PSY基因在菠菜中的生物学功能,以及响应红蓝光比例变化的调控机理奠定了基础.

番茄转录因子S1NAC1调控多种生物和非生物胁迫应答,但其上游转录调控因子至今不明,限制了对其胁迫应答机制的理解.构建了系列5'-缺失的SlNAC1启动子(起始密码子上游2 039 bp、1 508 bp、1 373 bp和777 bp)驱动的GUS转基因烟草,并定量分析了其在低温、高温和ABA诱导下的GUS酶活,以鉴定SlNAC1启动子中的低温、高温和ABA应答顺式元件.结果显示,低温和高温诱导后,2 039 bp启动子转基因烟草GUS酶活的增长显著高于其他转基因烟草和野生型烟草;而ABA诱导后,1 508 bp启动子转基因烟草GUS酶活的增长显著高于其他转基因烟草和野生型烟草.这些结果说明低温和高温应答顺式元件位于-2 039～-1 508 bp区间,而ABA应答顺式元件位于-1 508～-1 373 bp区间.启动子顺式元件预测分析显示,-2 039 bp～-1 508 bp区间只有1个低温/高温/干旱/盐应答顺式元件DRE/CRT,而-1 508 bp～-1 373 bp区间只有1个ABA应答顺式元件ABRE.因此,这两个顺式元件将作为候选元件用于后续SlNAC1上游调控转录因子的筛选.

土壤镉(Cd2+)污染严重制约设施蔬菜的产量和品质.褪黑素(MT)可以增强植株对多种逆境的抗性,然而Cd2+胁迫下MT调控番茄(Solanum lycopersicum)种子萌发的下游信号尚不清楚.该研究以番茄野生型Alisa Craig种子为材料,探究不同浓度Cd2+处理及外源MT对番茄种子萌发的调控效应.结果表明,0.5 mmol·L-1以上的Cd2+处理显著抑制番茄种子的萌发和幼苗生长.用0.15 mmol·L-1 MT浸种可降低种子萌发后地下部和地上部的Cd2+含量,有效缓解Cd2+胁迫对番茄种子萌发和幼苗生长的抑制作用.MT上调了番茄胚根中植物螯合肽和转运蛋白基因(PCS、NRAMP1、ABCC3、HMA3与ABCG5)的表达,促进Cd2+的跨膜转运以及液泡隔离.此外,MT减轻了Cd2+诱导的氧化损伤,除褪黑素自身的抗氧化作用外,也与抗氧化酶(CAT、APX与ALDH)活性的增强相关.进一步分析表明,MT显著下调了Cd2+胁迫下脱落酸(ABA)合成基因(NCED1和NCED2)的表达,并上调了ABA分解基因ABA8ox1的表达,降低ABA含量,从而有效调节赤霉素/脱落酸(GA/ABA)的比值,促进Cd2+胁迫下番茄种子的萌发.

植物应答非生物胁迫与微管的动态变化有着密切的联系,而微管蛋白的结构和功能通过微管结合蛋白(microtubule-associated proteins,MAPs)进行调控.MAP70-1 是一种微管结合蛋白,为了揭示MAP70-1 响应干旱胁迫的分子机制,该研究以苹果砧木M26 为材料,采用PCR 方法,克隆MdMAP70-1基因(登录号XM_008390949),并进行生物信息学分析;采用叶盘法转化'黄珍珠'番茄,并进行抗旱性分析.结果显示:(1)成功克隆得到苹果MdMAP70-1,其开放阅读框(ORF)为1 860 bp,编码619 个氨基酸,相对分子量为68.77 kD,等电点8.64;多序列比对和系统进化分析表明,苹果MdMAP70-1 具有MAP70 家族蛋白的保守结构域,与葡萄VvMAP70-1 蛋白(Vitis vinifera VIT_201s0011g05790)的亲缘关系较近.(2)用农杆菌介导的叶盘法转化野生型番茄,经抗性筛选获得12株阳性植株,PCR检测获得分别含有目的条带(1 860 bp 和680 bp)的8个过表达株系,证明Md MAP70-1 基因已转入番茄中;qRT-PCR检测并选择表达量显著高于野生型的3 个转基因番茄株系OE-1、OE-2 和OE-3.(3)T3代转基因番茄干旱胁迫抗性分析表明,干旱胁迫0d和5 d,过表达番茄株系叶片的相对含水量(RWC)、脯氨酸(Pro)含量、可溶性蛋白(SP)含量及抗氧化酶活性等与野生型(WT)对照无差异;胁迫10 d和15 d时,过表达Md MAP70-1 转基因番茄植株的RWC、Pro含量、SP含量及抗氧化酶活性显著高于WT,而相对电导率(REC)和MDA含量较WT降低.研究表明,番茄中过表达苹果Md MAP70-1 基因能够提高番茄体内RWC、Pro、SP含量以及SOD、POD和CAT活性,并降低REC和MDA含量,增强番茄的抗旱性;该研究结果为利用MdMA P70-1基因提高植株的耐旱性研究以及微管结合蛋白的功能研究奠定了基础.

蓖麻根腐病是茄腐镰孢菌(Fusarium solani)引起的根部病害,严重影响蓖麻产量.抗源缺乏制约了抗病品种的选育.为寻找抗病种质、建立抗性分子标记,该研究对 252 份蓖麻材料的抗性进行了表型和分子标记鉴定.结果表明:(1)浓度为 1×106个?mL-1的孢子悬浮液灌根是一种有效的接种方法;以接种后枯萎天数为基础的 5 级评价法,可作为鉴定标准.(2)鉴定出 130 份抗病材料,其中高抗为 105 份.(3)野生材料中抗病材料比率(66%)远高于栽培材料(35%),建议将野生材料,尤其是中国华南野生材料的研究利用作为今后抗病育种的重要方向.(4)初步建立了8 个与抗性关联的SSR标记.该研究结果提供了有效的根腐病抗性鉴定方法和评价标准,筛选出了一批育种迫切需要的抗病基因资源,初步建立了可用于辅助选择的SSR标记,为蓖麻抗根腐病育种奠定了重要基础.

MYB是植物中最大的转录因子家族之一,其中R3-MYB转录因子RADIALIS(RAD)在金鱼草(Antirrhinum majus)花发育过程中具有十分重要的作用.本研究对金鱼草基因组进行分析,发现1个与RAD结构相似的R3-MYB基因,将其命名为Am RADIALIS-like 1(Am RADL1).进一步通过生物信息学预测基因功能,利用q RT-PCR分析Am RADL1在野生型金鱼草不同组织器官中的相对表达量,对过表达Am RADL1的转基因金鱼草进行形态学观察和组织学染色分析.结果表明,Am RADL1基因开放阅读框(open reading frame,ORF)长度为306 bp,编码101个氨基酸,具有典型的SANT结构域,C末端含有CREB motif,与番茄(Solanum lycopersicum)Sl FSM1同源性较高.q RT-PCR结果表明,Am RADL1在根、茎、叶和花中均有表达,其中在花中表达量较高;进一步分析其在不同花器官中的表达量差异,发现Am RADL1在心皮中表达最高.转基因金鱼草植株的组织学染色分析结果显示,与野生型相比,转基因植株的心皮细胞大小没有明显的变化,但心皮中胎座区域变小,细胞数目减少.综上所述,Am RADL1可能参与调控心皮发育,但在心皮中的具体作用机制还有待进一步研究.

[目的]研究Ⅲ型效应子GALAs对青枯菌OE1-1在不同寄主植物致病性上的影响.[方法]构建青枯菌OE1-1的多种GALA缺失突变体,通过根切和叶片注射等方法研究GALAs对青枯菌OE1-1致病力和细胞内增殖能力的影响.[结果]GALA多基因缺失突变体对寄主烟草的致病力减弱,在烟草体内细菌繁殖能力较野生型明显降低,但在寄主番茄上不影响其致病性.[结论]GALA效应子对青枯菌OE1-1在烟草植株致病性上展现协同作用.