目的 构建稳定表达Cas9蛋白的工具细胞,并利用短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)编辑技术改造1型单纯疱疹病毒(HSV-1),获得ICP34.5基因敲除的oHSV-1/Ecfp重组病毒.方法 利用慢病毒包装体系,将包装Cas9表达质粒的病毒感染HEK293T细胞,然后经嘌呤霉素筛选获得稳定表达Cas9蛋白的293T-Cas9细胞株,通过聚合酶链式反应(PCR)及蛋白质免疫印迹技术检测Cas9基因及蛋白表达情况;利用分子克隆技术构建HSV-1病毒ICP34.5基因敲除的基因编辑质粒(pU6-Ecfp);pU6-Ecfp转染293T-Cas9细胞后感染野生型HSV-1病毒,在胞内通过CRISPR/Cas9技术敲除HSV-1病毒中ICP34.5基因,再利用增强型青色荧光(Ecfp)示踪及极限稀释法进行病毒富集纯化,通过PCR法进行oHSV-1/Ecfp病毒鉴定.结果 PCR扩增、核酸电泳及蛋白质免疫印迹技术结果显示,细胞株293T-Cas9高转录Cas9基因及高表达Cas9蛋白;通过PCR鉴定及荧光示踪结果显示,基因编辑质粒pU6-Ecfp构建成功;Ecfp荧光示踪、PCR扩增及核酸电泳结果显示,Ecfp成功插入ICP34.5基因敲除位点,获得oHSV-1/Ecfp重组病毒.结论 稳定表达Cas9蛋白的293T-Cas9细胞可作为CRISPR/Cas9基因编辑的工具细胞,构建的HSV-1/Ecfp病毒实现了ICP34.5基因敲除及Ecfp示踪蛋白的敲入.

目的 建立一种快速、准确、灵敏的多重PCR检测方法,用于同时鉴别6种常见食用肉类(牛、羊、鸡、猪、鹅、鸭),并评估其在肉类食品掺假鉴定中的应用价值.方法 基于GenBank数据库中6个物种的线粒体全基因组序列,筛选具有种内保守性、种间特异性的DNA序列(牛16S rRNA、羊COX-1、鸡Cytb、猪COX-1、鹅NADH2、鸭16S rRNA),并设计物种特异性引物,以此构建一个可同时鉴别6种常见食用肉类的多重PCR检测体系.对该体系进行种属特异性、灵敏度和重复性研究,并进行模拟混合样品检测.结果 成功构建了一个可同时鉴别6种常见食用肉类的多重PCR检测体系,该体系在非目标物种的DNA中均未有效扩增;在DNA模板量为0.0625～2 ng/μL时,6个物种的扩增产物均能检见.在鸭肉和牛肉混合比例低至0.5%时,仍能检测到鸭肉成分.结论 本研究构建了一个特异性强、灵敏度高、重复性好的多重PCR检测体系,可准确鉴别6种常见食用肉类食品中的动物源性成分,为我国常见食用肉类及肉制品的掺假鉴定提供了一种简单、实用的检测技术.

2021年4月15—17日，来自疾控、医疗、高校和科研院所的80余位专家聚焦我国传染病防控与生物安全面临的挑战与机遇，聚焦大数据和监测网络、检测与溯源技术、耐药控制和疫苗研发策略的关键问题等内容展开深入讨论，并达成共识：（1）针对我国面临的传染病防控现状和保障生物安全的需要，亟需建立跨部门、全方位的微生物科学数据库和实验室监测网络；（2）病原筛查鉴定和分型溯源技术需向超灵敏、智能化和网络化的方向发展，应规范基于高通量测序的病原鉴定和溯源技术的标准及应用范围；（3）亟需建立跨部门的耐药监测体系，加强耐药菌跨物种传播监测；（4）应用科学理论和新技术指导和改进未来疫苗应急研发及接种策略。根据以上问题提出专家建议。

目的:基于多重聚合酶链式反应（PCR）与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）联用的高通量检测技术，构建不同菌种的特征性单核苷酸多态性图谱以建立血流感染病原菌快速、准确、高灵敏的诊断方法。方法:选取血流感染常见的大肠埃希菌等7种病原菌作为检测对象，优化多重PCR条件，采用MALDI-TOF MS检测各目标菌特征峰，建立多重PCR联合质谱检测体系；分别设计普通引物对及中部同序引物对，分析引物二聚体的形成情况；采用模拟的细菌感染血液样本，测定上述建立体系的特异度及灵敏度；收集2020年6—9月解放军总医院检验科疑似菌血症患者血液样本150份，并将上述体系的鉴定结果与临床应用的传统鉴定方法结果使用χ2检验进行比较。结果:本研究设计的中部同序引物对的引物二聚体循环阈值（Ct）值在38以上，比普通引物对延迟出现6~10个循环；建立的联合质谱检测体系可同时检测分为两组的7种细菌，目标菌均可检测到特异的产物峰，除目标菌外的临床菌株只有引物峰，所有图谱无非特异的杂峰；大肠埃希菌的灵敏度可以达到50 CFU/ml，其余各菌的检测限为100 CFU/ml；对150例患者的血液样本进行检测，传统方法鉴定出阳性46例，阳性检出率为30.67%（46/150），包括2例混合感染，联合质谱方法鉴定出阳性48例，阳性检出率为32.0%（48/150），包括3例混合感染；阴性符合率为100%（101/101），核酸质谱敏感度为97.82%（45/46），特异度为97.11%（101/104），一致性检验Kappa=0.938（ P=0.625），2种方法检测一致性良好。 结论:所建立的检测体系不仅能快速、准确地鉴定引起血流感染的7种常见病原菌，有效缩短传统培养鉴定所需时间，还可检测多重细菌混合感染，弥补混合感染漏检可能。该方法也可用于其他病原菌的鉴定。

目的:开发建立新型高敏锌转运体8自身抗体（ZnT8A）电化学发光检测法（ECL-ZnT8A），并初步评价其临床应用价值。方法:选择自2016年1月至2019年12月就诊于南京医科大学第一附属医院的1型糖尿病（T1DM）患者100例、2型糖尿病（T2DM）患者150例、健康对照者360例（158例用于方法的建立，202例用于方法灵敏度和特异度的鉴定）进行ECL-ZnT8A检测，120例（60例健康对照，50例T1DM，10例ZnT8A阳性血清）同时检测ECL-ZnT8A和放射免疫沉淀法（RBA）-ZnT8A。经 t检验、单因素方差分析和χ2检验比较各组间ZnT8A指数和阳性率的差异。 结果:（1）400 ng/ml的ZnT8-Biotin和200 ng/ml的ZnT8-Sulfo-TAG是ECL-ZnT8A反应体系的最适浓度。（2）ECL-ZnT8A批内变异系数为3.4%~8.2%，批间变异系数为10.5%~12.8%，阴、阳性结果判断重复性100%。（3）ECL-ZnT8具有较高的灵敏度（97.7%）和特异度（96.1%），与RBA-ZnT8A的一致率为96.70%（116/120,Kappa值为0.929），指数呈显著正相关（ r=0.806， P<0.01）。（4）T1DM患者ECL-ZnT8A阳性率为52.00%（52/100），显著高于健康对照组的0.99%（2/202）（χ2 =118.528， P<0.01）和T2DM组的1.33%（2/150）,差异具有统计学意义（χ2 =90.955， P<0.01）。 结论:ECL-ZnT8A检测操作简便无放射污染，具有很好的临床应用价值。

目的:利用3D TableTrix TM干细胞微载体培养脐带来源间充质干细胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs），并进一步评价其修复兔膝关节软骨缺损的效果。 方法:将UC-MSCs在3D TableTrix TM体系中培养7 d后，评价细胞活力并通过细胞形态观察、三向分化以及流式细胞术进行干细胞鉴定。通过植入裸鼠皮下进行病理组织学观察，进一步评价3D TableTrix TM体系的生物安全性。将12只新西兰大白兔制作双膝关节股骨滑车软骨缺损模型，后随机分为两组：对照组，不予任何治疗；UC-MSCs组，置于载有UC-MSCs的3D TableTrix TM（UC-MSCs组）。于术后3、6个月分别取材，进行大体观察、HE染色、甲苯胺蓝染色、Masson染色并对比观察，并依照国际软骨修复协会（International Cartilage Repair Society，ICRS）大体观和组织学评分对再生组织的进行定量评价。 结果:UC-MSCs在3D TableTrix TM体系中存活良好，培养7 d后活死染色未见明显死细胞，且在三维支架内部实现了明显增殖。将细胞消化后进行鉴定，证实细胞保持了其作为干细胞的特征。裸鼠皮下植入28 d后，见团块形成，外有纤维包膜包裹。HE染色可见3D TableTrix TM支架结构完整并有新生血管长入。在体内研究中，将3D TableTrix TM填充软骨缺损区域，经过3个月和6个月的观察，显示UC-MSCs组的软骨修复效果优于对照组，且3个月及6个月的ICRS大体观评分分别为（8.50±0.58）分和（11.25±0.96）分，高于对照组（4.50±0.58）分和（8.75±0.50）分，差异均有统计意义（ P<0.05）；3个月及6个月的组织学评分分别为（11.00±2.16）分和（17.00±0.82）分，亦高于对照组的（5.25±0.50）分和（11.25±0.96）分，差异有统计学意义（ P<0.05）。 结论:3D TableTrix TM干细胞微载体为干细胞培养提供了理想的微环境，并可以用于软骨缺损的治疗。

目的:建立检测与鉴定布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA的巢式PCR方法。方法:通过全基因组序列比较，分析布鲁氏菌A19疫苗株与其他布鲁氏菌全基因组序列的差异位点，依据差异位点设计引物，建立检测与鉴定布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA的巢式PCR方法。提取布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA，倍比稀释后作为模板DNA，应用建立的巢式PCR方法进行灵敏性测试；同时，应用建立的巢式PCR方法检测除布鲁氏菌A19疫苗株之外的其他布鲁氏菌及非布鲁氏菌菌株基因组DNA，进行特异性测试。结果:建立的巢式PCR方法检测布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA最低检出限为3.43 fg，扩增结果显示，出现246 bp电泳条带，其他布鲁氏菌菌株出现314 bp电泳条带，而非布鲁氏菌菌株均未扩增出电泳条带。结论:建立的巢式PCR方法具有灵敏性高、特异性强的特点，反应体系中存在1个拷贝数的布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA，即可检测到，本方法适用于标本中布鲁氏菌A19疫苗株微量基因组DNA的检测与鉴定。

目的:对肺炎克雷伯菌(KP)中标注的氨基肽酶(PepA)进行序列扩增与蛋白表达，鉴定其酶活特性。方法:根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP PepA基因序列(Reference Sequence：NZ_CP045783.1)设计扩增引物，以本科室前期分离到的一株KP基因组为模板，通过聚合酶链反应(PCR)扩增出PepA基因全长，使用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接至表达载体pET-30a。将重组质粒pET-30a-PepA转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达出KP PepA蛋白，使用N 2＋层析柱对重组His标签蛋白进行纯化。以亮氨酸-对硝基苯胺(Leu-pNA)为底物，测定KP PepA对其水解能力，并摸索不同的反应温度和pH值条件对水解反应的影响。在反应体系中加入不同二价金属离子，观察各离子对KP PepA氨基肽酶活性的作用。组间比较采用 t检验。 结果:扩增出长度为1 527 bp的KP PepA基因，并获得可溶性KP PepA蛋白，大小为56.1×10 3，与预测大小一致。KP PepA加入组反应产物pNA浓度显著高于KP PepA不加组[(205.00±5.00) μmol/L比(8.00±2.00) μmol/L， t＝63.36， P<0.01]，表明重组KP PepA可以水解Leu-pNA。KP PepA水解Leu-pNA的最适温度为37 ℃，最适pH值为pH 8.0。Co 2＋、Mn 2＋均可以提高KP PepA酶活性，其中Co 2＋激活作用最强，加入Co 2＋组的相对酶活性显著高于不加离子组(181.70±7.64比95.00±0.00， t＝16.44， P<0.01)；Zn 2＋、Fe 2＋均可以抑制KP PepA酶活性，其中Zn 2＋抑制作用最强，加入Zn 2＋组的相对酶活性显著低于不加离子组(44.67±8.97比95.00±0.00， t＝8.49， P<0.01)。 结论:肺炎克雷伯菌中标注的PepA具有体外氨基肽酶活性。

目的:建立实时荧光定量PCR方法检测布鲁氏菌基因组内IS711转座酶基因（orfA基因）的拷贝数，并应用于布鲁氏菌种与生物型的鉴定。方法:构建基于Taqman探针法实时荧光定量PCR技术的orfA基因拷贝数的检测体系。设计bcsp31基因和orfA基因的引物和探针，应用实时荧光定量PCR方法同时检测同一菌株相同DNA浓度下的bcsp31基因和orfA基因含量，获得2个基因的循环数（CT值），再根据bcsp31基因和orfA基因CT值的差异，换算出待检测布鲁氏菌菌株基因组内orfA基因的拷贝数。同时，将布鲁氏菌16M菌株DNA进行2倍递减稀释，验证检测体系的稳定性。结果:当16M菌株DNA浓度相差2倍时，实时荧光定量PCR方法同时检测bcsp31基因和orfA基因，测得的CT值差值均值均为1.00，95%置信区间为0.95~1.05，标准差为0.17，变异系数为0.17。应用该检测体系检测30株布鲁氏菌菌株DNA中orfA基因的拷贝数，发现羊种生物1~3型菌株分别有6、9和7个拷贝数；猪种生物2型菌株有10个拷贝数，与其他4个猪种生物型（1、3~5）菌株拷贝数不同；绵羊附睾种菌株有37个拷贝数；8个牛种生物型（1~7、9）菌株拷贝数稳定在5~6个。结论:成功建立了一种检测布鲁氏菌orfA基因拷贝数的实时荧光定量PCR方法，该方法能够鉴定部分布鲁氏菌种与生物型菌株。

目的:研究Ⅰ、Ⅳ fimA型牙龈卟啉单胞菌脂多糖（ Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide，Pg-LPS）对共培养条件下人脐动脉平滑肌细胞（human umbilical artery smooth muscle cell，HUASMC）增殖和迁移能力的影响，探讨牙周炎与动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）相关的生物学基础和机制。 方法:厌氧培养Ⅰ、Ⅳ fimA型Pg，分别提取、纯化并鉴定两型Pg-LPS；体外原代培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）和HUASMC，并采用鼠尾Ⅰ型胶原建立HUVEC-HUASMC共培养细胞模型；实验分为T1组（质量浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的ⅠfimA型Pg-LPS刺激共培养细胞）和T2组（质量浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的ⅣfimA型Pg-LPS刺激共培养细胞），以及阴性对照组（不加LPS组）；细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）法检测HUASMC的增殖能力，Transwell迁移小室观察HUASMC的迁移能力。比较各组不同质量浓度Pg-LPS刺激共培养细胞2、8、24及48 h后，HUASMC的增殖及迁移能力的变化。结果:共培养细胞在Ⅰ、Ⅳ fimA型Pg-LPS的作用下，在24及48 h时，两型Pg-LPS的各质量浓度组中，HUASMC的 A值均较阴性对照组显著上调（ P<0.05）；在48 h时5.0、10.0 mg/L ⅣfimA型Pg-LPS 刺激共培养细胞后，HUASMC的 A值（分别为1.386±0.044、1.455±0.058）均显著高于相同浓度ⅠfimA型Pg-LPS刺激共培养中HUASMC的 A值（分别为1.168±0.064、1.204±0.088）（ P<0.05）；此外，在48 h时，5.0、10.0 mg/L Ⅳ fimA型Pg-LPS 刺激共培养细胞后，HUASMC的 A值均显著高于0.5、1.0 mg/L Ⅳ fimA型Pg-LPS 刺激共培养中HUASMC的 A值（分别为1.170±0.082、1.239±0.089）（ P<0.05）。HUASMC的迁移结果显示，在8、24及48 h时，Ⅰ、ⅣfimA型Pg-LPS各质量浓度组中，HUASMC的迁移数量均较同组内2 h时相同Pg-LPS质量浓度下HUASMC迁移数量显著上调（ P<0.05）；在48 h时，除10.0 mg/L ⅣfimA型Pg-LPS外，其余各Pg-LPS质量浓度组HUASMC的迁移数量均较同组内24 h时相同Pg-LPS质量浓度下HUASMC迁移数量显著增加（ P<0.05）；且在48 h时，2.0 mg/L Ⅳ fimA型Pg-LPS刺激共培养细胞后，HUASMC的迁移数量（204.00±20.98）较相同浓度下Ⅰ fimA型Pg-LPS刺激后HUASMC迁移数量（141.89±18.28）显著上调（ P<0.05）；在同一观察时点，同型Pg-LPS浓度越高，HUASMC的迁移数量越多（ P<0.05）。 结论:Ⅰ、ⅣfimA型Pg-LPS均能促使共培养细胞中HUASMC的增殖和迁移能力增强；Pg-LPS的毒力与其fimA基因型相关，ⅣfimA型Pg-LPS较ⅠfimA型Pg-LPS刺激作用更显著，更易导致HUASMC功能紊乱，从而为重度牙周炎更易促进As的进展提供依据。