目的 利用卤代芳烃的亲核取代反应在芳环中引入二甲氨基,探讨反应条件对硝基取代的芳香卤代烃胺化反应的影响.方法 以 2-溴-1-氟-4-硝基苯作为模型探究最佳反应条件,并用不同位置、不同卤原子取代的硝基苯探究反应底物的范围.结果 反应最佳反应条件为使用 1.00 mL的N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide,DMF)为胺化剂,1.5 倍当量KOH提供碱性环境,5.00 mL的低共熔溶剂(deep eutectic solvents,DESs)(氯化胆碱∶甘油=1∶2)为溶剂,在80℃下反应24 h.在底物范围扩展中有效得到一系列 4-二甲氨基硝基苯化合物及其衍生物,经 1H-NMR、13C-NMR确证其结构.结论 DMF在DESs中可以有效充当二甲氨基化试剂,DESs溶剂选择性提高硝基对位上的卤原子的亲核取代反应活性,且不活化邻位卤原子,在优化后的最佳条件下反应,最高产率可达 84%.这种特殊的区域选择性是其他溶剂中不具备的优势,同时该方法具有绿色环保、简单方便、产率适中的特点.

目的:对肺炎克雷伯菌(KP)中标注的氨基肽酶(PepA)进行序列扩增与蛋白表达，鉴定其酶活特性。方法:根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP PepA基因序列(Reference Sequence：NZ_CP045783.1)设计扩增引物，以本科室前期分离到的一株KP基因组为模板，通过聚合酶链反应(PCR)扩增出PepA基因全长，使用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接至表达载体pET-30a。将重组质粒pET-30a-PepA转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达出KP PepA蛋白，使用N 2＋层析柱对重组His标签蛋白进行纯化。以亮氨酸-对硝基苯胺(Leu-pNA)为底物，测定KP PepA对其水解能力，并摸索不同的反应温度和pH值条件对水解反应的影响。在反应体系中加入不同二价金属离子，观察各离子对KP PepA氨基肽酶活性的作用。组间比较采用 t检验。 结果:扩增出长度为1 527 bp的KP PepA基因，并获得可溶性KP PepA蛋白，大小为56.1×10 3，与预测大小一致。KP PepA加入组反应产物pNA浓度显著高于KP PepA不加组[(205.00±5.00) μmol/L比(8.00±2.00) μmol/L， t＝63.36， P<0.01]，表明重组KP PepA可以水解Leu-pNA。KP PepA水解Leu-pNA的最适温度为37 ℃，最适pH值为pH 8.0。Co 2＋、Mn 2＋均可以提高KP PepA酶活性，其中Co 2＋激活作用最强，加入Co 2＋组的相对酶活性显著高于不加离子组(181.70±7.64比95.00±0.00， t＝16.44， P<0.01)；Zn 2＋、Fe 2＋均可以抑制KP PepA酶活性，其中Zn 2＋抑制作用最强，加入Zn 2＋组的相对酶活性显著低于不加离子组(44.67±8.97比95.00±0.00， t＝8.49， P<0.01)。 结论:肺炎克雷伯菌中标注的PepA具有体外氨基肽酶活性。

目的:建立工作场所空气中N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基甲基乙胺、N-亚硝基二丁胺、N-亚硝基正丙胺、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基二苯胺和N-亚硝基吡咯烷8种N-亚硝胺化合物的气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）检测方法。方法:于2023年1至8月，以ThermoSorb/N柱采集工作场所中空气中8种N-亚硝胺，用4 ml甲醇-二氯甲烷（体积比1∶1）溶液解吸，VF-624 ms毛细管色谱柱分离，多反应监测模式检测，外标法定量，并对方法的检出限和精密度等指标进行分析。结果:8种N-亚硝胺测定方法的线性范围为1.0~20.0 μg/L，相关系数0.999 3~0.999 9，方法检出限0.051~0.132 μg/L，最低定量浓度0.030~0.078 μg/m 3（以空气体积22.5 L，解吸液体积4.0 ml计），批内精密度2.05%~6.89%，批间精密度2.41%~8.26%，解吸效率67.20%~102.60%；样品在4 ℃条件下至少可保存7 d。 结论:GC-MS/MS测定工作场所空气中8种N-亚硝胺方法的灵敏度高、精密度好，可准确测定工作场所空气中8种N-亚硝胺含量。

目的:探讨肿瘤酸性微环境响应铁基金属有机框架(Iron-containing Metal Organic Frameworks,Fe-MOF)纳米探针对乳腺癌光动力增敏铁死亡及其体外MRT1激活效应.方法:制备Fe-MOF纳米探针,用透射电子显微镜(Transmission Electron Micro-scope,TEM)及原子力显微镜(Atomic Force Microscope,AFM)对其形态进行表征;采用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)评价其在溶液水平ROS生成及GSH消耗能力;通过细胞毒性实验(MTT)测定纳米探针在暗毒性及光毒性条件下对4T1乳腺癌细胞的光动力增敏铁死亡的效能;将4T1细胞与Fe-MOF共孵育后,协同激光照射处理,使用荧光显微镜观察其活性氧(Reactive Oxygen Specis,ROS)、脂质过氧化物(Lipid PerOxide,LPO)的生成以及细胞活/死染色情况;观察纳米探针在不同的pH条件下T1加权成像的激活效应,并在细胞水平测量不同时间点的T1激活效能.结果:制备的Fe-MOF纳米探针呈针状结构,厚度约为44 nm;在体外溶液水平可有效促进ROS的生成及LPO的消耗;荧光显微镜结果显示Fe-MOF触发的铁死亡效应联合光动力治疗可有效促进细胞内ROS和LPO的生成,以及肿瘤细胞死亡率升高(P＜0.001);MR成像结果显示,在酸性条件下纳米探针的T1信号可被特异性激活,pH 5.0条件下r1弛豫率为4.954 mM-1s-1,具有较好pH响应性及细胞水平时间依赖性激活效能.结论:pH响应诊疗一体化的Fe-MOF纳米探针可实现乳腺癌的光动力增敏铁死亡效能以及MR微环境响应激活成像.

目的 探讨维生素D对特应性皮炎小鼠的保护作用及其作用机制.方法 将清洁级的50只BALB/c雄性小鼠随机分为空白组、模型组、对照组和低、高剂量实验组,每组10只.除空白组外,其余组小鼠用2,4-二硝基氟苯(DNCB)进行建模,低、高剂量实验组小鼠建模后分别每天背部均匀涂抹5、10 μg·kg-1的1,25(OH)2D3,对照组每天均匀涂抹氢化可的松溶液(1 mg·cm-2),每天2次,连续给药10 d,空白组和模型组小鼠每天涂抹等量的0.9％NaCl.给药结束后对皮肤病变状况进行评估,眼眶采血并收集小鼠背部皮肤组织备用.以苏木精-伊红染色观察皮肤表皮厚度,以甲苯胺蓝染色法检测肥大细胞数量,以酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血清免疫球蛋白E(IgE)、白细胞介素(IL)-13、IL-4、IL-17表达水平,以流式细胞术检测血清Th1、Th2细胞比例,以免疫组化法检测背部皮肤组织组胺1型受体(HIR)、蛋白酶激活受体2(PAR2)、瞬时受体电位香草素1(TRPV1)表达情况.结果 空白组、模型组、低剂量实验组、高剂量实验组和对照组小鼠的皮炎症状评分分别为0、(8.50±1.12)、(6.34±0.54)、(3.91±0.29)和(3.79±0.53)分,背部皮肤表皮厚度分别为(42.05±4.14)、(77.65±7.02)、(61.12±5.02)、(55.34±4.13)和(52.19±3.08)μm,背部组织肥大细胞数量分别为(4.67±0.27)、(32.16±2.49)、(25.23±2.07)、(18.13±1.46)和(15.37±1.29)number·mm-2,Th1/Th2 细胞比值分别为 2.76±0.28、0.36±0.06、1.02±0.18、2.05±0.14 和 2.07±0.29,HIR 表达水平分别为 0.05±0.00、0.21±0.02、0.16±0.02、0.10±0.01 和 0.08±0.01,PAR2 表达水平分别为 0.05±0.01、0.19±0.01、0.12±0.01、0.09±0.01 和 0.07±0.01,TRPV1 表达水平分别为0.05±0.01、0.25±0.03、0.15±0.01、0.10±0.01 和 0.09±0.00;以上指标,低剂量实验组、高剂量实验组、对照组分别与模型组比较,高剂量实验组和低剂量实验组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 维生素D可通过调节Th1/Th2细胞平衡,减轻DNCB诱导的特应性皮炎,可能与HIR、PAR2介导的TRPV1痒信号通路有关.

菌株 2-1-1 于贵州大学校园樱花树干子实体中分离,通过形态学结构、ITS 序列及系统发育树分析,鉴定其为白囊耙齿菌Irpex lacteus,对菌株 2-1-1产生的 3种木质素降解酶进行测定,发现菌株可分泌漆酶(laccase,Lac)、木质素过氧化物酶(lignin peroxidase,LiP)和锰过氧化物酶(manganese peroxidase,MnP).利用菌株 2-1-1 对固体培养基条件下 7 种染料的脱色能力进行检测,筛选出较易脱色的刚果红染料,同时采用气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectroscopy,GC-MS)分析确定经白囊耙齿菌降解的刚果红染料代谢产物,并对其进行脱色条件优化和毒力测验,试验分析表明:菌株 2-1-1 对 7 种染料均有脱色,对刚果红脱色效果较佳.GC-MS分析刚果红染料降解产物主要为联苯胺、联苯、苯乙烯、十六烷和3-硝基苯酚.单因素和综合优化脱色条件:染料浓度 50 mg/L,碳源为果糖、金属离子为锌离子、pH 7,该条件下刚果红染料脱色效果最优.优化条件下菌株 2-1-1 对刚果红染料脱色率达 91.03%,相比对照组脱色率提高 17.13%,刚果红染料经菌株 2-1-1 脱色前后毒力测试:染料原液>脱色后>清水处理,表明该菌株可降低刚果红染料毒性.

氨肽酶A(aminopeptidase A,Pep A)能特异性地水解N末端为谷氨酸(glutamic acid,Glu)或天冬氨酸(aspartic acid,Asp)的肽链,提高蛋白质的水溶性和食物的风味,在食品工业和肉类加工中具有一定的应用前景.本研究采用全基因合成的方式获得了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis ssp.lactis)IL1403 氨肽酶A(Lactococcus lactis-Pep A,Lc-Pep A)的编码基因,将该基因克隆并导入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115(His4),在毕赤酵母中实现了Lc-Pep A的高效分泌表达,表达产物经鉴定和纯化制备后,进行了生物学特性的分析.结果表明,Lc-Pep A具有较强的底物特异性,对 2 种底物谷氨酸对硝基苯胺(glutamic acid-p-nitroaniline,Glu-pNA)和天冬氨酸对硝基苯胺(aspartic acid-p-nitroaniline,Asp-pNA)具有相似的催化活力和酶动力学参数.Lc-Pep A是一种金属蛋白酶,最适反应温度为 60℃,最适pH为 8.0,具有较宽的热稳定性和酸碱稳定性.金属离子Co2+、Mn2+及Zn2+等对酶活力具有不同程度的激活作用,而Ni2+和Cu2+对酶活力具有强烈的抑制作用.Lc-Pep A 对常规蛋白酶抑制剂不敏感,但能被金属蛋白酶抑制剂、EDTA 及二硫键还原剂抑制.这些研究为Lc-Pep A的生产和指导该酶的应用打下了坚实的基础.

目的:探讨地黄饮对特应性皮炎(AD)模型小鼠的作用及机制.方法:将36只雌性BALB/c小鼠随机分为空白组、模型组、对照组、地黄饮低剂量组、地黄饮中剂量组、地黄饮高剂量组.除空白组外,其余各组均采用2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene,DNCB)反复刺激小鼠背部皮肤诱导AD模型,对照组及地黄饮低、中、高剂量组给予相应药物灌胃,空白组及模型组小鼠予生理盐水灌胃.计算各组小鼠炎症程度评分、脏器指数(胸腺、脾脏),取背部皮损用HE染色、甲苯胺蓝染色观察组织病理学及肥大细胞变化,ELISA法检测小鼠血清总免疫球蛋白E(IgE)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)水平,并将血清IgE、IFN-γ、IL-4水平与皮损炎症程度评分进行相关性分析.结果:与空白组比较,模型组小鼠背部皮肤出现水肿、糜烂、干燥或苔藓样改变,HE染色示小鼠背部皮肤角化不全、增厚,有炎症细胞浸润;与模型组比较,地黄饮低、中、高剂量组小鼠背部皮肤水肿、糜烂、干燥或苔藓样改变有所改善,皮肤角化不全、增厚、炎症细胞浸润情况减轻.模型组小鼠皮损炎症程度评分、肥大细胞数量、脾脏指数及血清IgE、IL-4水平高于空白组(P＜0.05),血清IFN-γ水平低于空白组(P＜0.05);地黄饮低、中、高剂量组皮损炎症程度评分、肥大细胞数量、脾脏指数及血清IgE、IL-4水平低于模型组(P＜0.05),血清IFN-γ水平高于模型组(P＜0.05).血清IgE、IL-4水平与皮损炎症程度评分呈正相关(P＜0.05);血清IFN-γ水平与皮损炎症程度评分呈负相关(P＜0.05).结论:地黄饮可能通过减少肥大细胞浸润,使免疫环境向Th2型细胞偏移的程度降低而缓解AD小鼠症状.

[背景]双乙酰(DC)被广泛应用于食品调味行业,过量职业接触会引起人体严重的呼吸系统疾病,但目前对于工作场所空气中DC尚缺乏相应的国家标准检测方法.[目的]建立 4-硝基邻苯二胺(NPDA)柱前衍生-高效液相色谱法测定工作场所空气中DC的方法.[方法]用溶液吸收法采集工作场所空气中DC,采用 4-硝基邻二苯胺作为衍生化试剂.通过调整吸收液磷酸浓度,优化反应试剂比例、反应温度和时间,建立测定工作场所空气中DC的高效液相色谱方法,得到线性、检出限、定量下限等性能指标.采用相对比较法评价方法采样效率,吸收液保存试验评价样品稳定性,加标回收试验评价方法准确度和精密度,并进行干扰试验.将所建立的方法应用于实际样品检测,考察方法的适应性.[结果]衍生化反应温度越高,反应时间越长,衍生化效率越高,因此选择 60℃衍生化 2 h.反应液经SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)分离,在 30℃柱温下,用甲醇-水(体积比:65%/35%)混合液为流动相,以 1.0 mL·min-1 的流速洗脱,紫外检测器(λmax=257 nm)检测,保留时间定性,外标法定量.本法DC检测范围为 5～2000 μg·L-1,相关系数为 0.9999,检出限为1.3 μg·L-1,定量下限为 4.3 μg·L-1,最低检出浓度为 4.3 μg·m-3,最低定量浓度为 14.3 μg·m-3(以采样体积V0=3.0 L计).本法样品加标回收率为 99.1%～100.8%,批内精密度为 0.5%～3.0%,批间精密度为 1.2%～2.0%.本法平均采样效率为 94.5%,样品在 4℃下至少可保存 14 d,工作场所空气共存成分不干扰DC的测定.本法检测某香精生产车间空气,DC含量为 5.86～8.85 mg·m-3.[结论]采用 1.0%磷酸吸收液采集、NPDA柱前衍生-高效液相色谱法测定空气中DC,方法简单实用,准确度好,灵敏度高,DC吸收液无损失降解,可应用于工作场所空气中DC的检测.

利用对硝基-N-乙酰苯胺筛选培养基从海州湾海域海泥中筛选获得产几丁质脱乙酰酶细菌MCDA02.经过形态学、生理生化和16S rDNA序列分析初步鉴定该菌株为解角质素微杆菌.通过单因素优化和正交试验优化,得出最优发酵条件.在单因素优化基础上,利用正交试验优化获得菌株MCDA02最优发酵条件为发酵温度25℃,培养基起始pH7.0,装液量50 mL/250 mL,几丁质3％,发酵时间48 h.在此发酵条件下,菌株MCDA02发酵水平达到158.47 U/mL,是优化前的3.2倍.试验结果为菌株MCDA02几丁质脱乙酰酶的进一步研究奠定基础.